曹　繪，李寶臣，李　漫，方維煥

(1.浙江大學動物預防醫(yī)學研究所，浙江杭州 310058；

2.浙江諾倍威生物技術有限公司)

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雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗不同佐劑的免疫效果試驗

曹繪1，2，李寶臣2，李漫2，方維煥1

(1.浙江大學動物預防醫(yī)學研究所，浙江杭州 310058；

2.浙江諾倍威生物技術有限公司)

摘要：為評價雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗不同佐劑的免疫效果，選用Marcol 52、T1和SNB白油及S71油佐劑與雞新城疫病毒和禽流感病毒混合制成滅活疫苗，免疫適齡SPF雞，比較不同佐劑對雞的安全性及新城疫和禽流感的血凝抑制(HI)抗體水平。結果表明，4種佐劑疫苗的安全性、穩(wěn)定性良好；應用T1白油佐劑的滅活疫苗，免疫SPF雞產(chǎn)生的新城疫和禽流感HI抗體水平優(yōu)于其他佐劑，免疫后2周檢測新城疫和禽流感的抗體水平均合格，確定為最佳白油佐劑。

關鍵詞：雞新城疫；禽流感；滅活疫苗；佐劑優(yōu)化

雞新城疫(ND)是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一，是一種急性高度接觸性傳染疾病，發(fā)病率和死亡率極高[1]。禽流感(AI)是由A型流感病毒(AIV)引起的烈性傳染病，H9亞型禽流感病毒感染雞群后，除了引起呼吸系統(tǒng)疾病，還影響生殖系統(tǒng)[2]。雞新城疫和禽流感是一種世界范圍的禽類疫病，給禽業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失，免疫接種是控制雞新城疫和禽流感的有效方法。但是，如將雞新城疫和禽流感H9亞型疫苗分別接種，不僅工作量大，且對雞體應激嚴重，故迫切需要生產(chǎn)能“一針防多病”的疫苗，雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗則成功地解決了這一問題。

目前，雞新城疫和禽流感(H9亞型)滅活疫苗大多采用白油作為佐劑，司盤80和吐溫80作為乳化劑[3-4]。由于不同廠家白油佐劑制備和純化工藝的差異，篩選出免疫效果好、安全性高的油佐劑對雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的提升有著重要意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1抗原雞新城疫病毒抗原和禽流感病毒(H9亞型)抗原由浙江諾倍威生物技術有限公司生產(chǎn)并提供(詳見表1)。

1.1.2佐劑選用Marcol 52、T1和SNB三種白油佐劑，S71油佐劑(詳見表2)。

表1　雞新城疫病毒抗原和禽流感病毒

表2　佐劑來源及產(chǎn)品型號

1.1.3主要器材FA25 model乳化剪切機，IPQ-3禽用隔離器等。

1.1.4實驗動物30-60日齡SPF雞和21-35日齡SPF雞，均由浙江諾倍威生物技術有限公司質(zhì)量管理部動物房提供。

1.2試驗方法

1.2.1病毒液的滅活及滅活檢驗將制備所得的兩種病毒液分別加入適量滅活劑進行抗原滅活，并按照2010年版《中華人民共和國獸藥典》第三部進行滅活檢驗[5]。

1.2.2疫苗制備將檢驗合格的新城疫病毒液和禽流感病毒液按照1∶1比例混合，再將混合后的病毒液與佐劑按照1∶2比例乳化后制成疫苗。將使用Marcol 52、T1、SNB和S71佐劑制成的滅活疫苗分別命名為A、B、C、D疫苗組。

1.2.3無菌檢驗根據(jù)《中國獸藥典》附錄所提供的方法進行檢驗，取樣品1 mL接種于含有50 mL硫乙醇酸鹽的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72 h，將培養(yǎng)物移植至TG小管和GA斜面各兩支(0.2 mL/支)，1支在37℃培養(yǎng)，1支在25℃培養(yǎng)，另取1支GP在25℃培養(yǎng)，觀察7 d。

1.2.4性狀檢驗各組滅活疫苗按照《中國獸藥典》進行性狀檢驗。

1.2.5安全檢驗選用30-60日齡SPF雞10羽，每羽頸部皮下注射疫苗0.1 mL，觀察14 d內(nèi)有否出現(xiàn)因疫苗引起的局部和全身性不良反應。

1.2.6效力檢驗

1.2.6.1新城疫效力檢驗選用30-60日齡SPF雞15羽，其中10羽每羽皮下注射疫苗0.2 mL，另5羽作為非免疫對照。免疫后21-28 d，每羽分別采血，分離血清，進行HI抗體效價測定。

結果判定：免疫組HI抗體效價不低于1∶16(微量法)，對照組不高于1∶4(微量法)。

1.2.6.2禽流感效力檢驗選用21-35日齡SPF雞15羽，其中10羽每羽皮下注射疫苗0.2 mL，另5羽作為非免疫對照。免疫后21-28 d，每羽分別采血，分離血清，進行HI抗體效價測定。

結果判定：免疫組HI抗體效價不低于1∶64(微量法)，對照組不高于1∶4(微量法)。

2結果與分析

2.1疫苗檢驗結果詳見表3、表4。

表3　不同油佐劑雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗性狀檢驗

表4　不同油佐劑雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗安全性檢驗

由表3和表4可見，各組滅活疫苗的滅活檢驗、無菌檢驗、性狀檢驗、安全檢驗均符合國家標準。注射部位無過敏反應及局部不良反應，疫苗吸收良好，未見形成肉芽組織。

2.2動物試驗結果詳見圖1、圖2。

圖1　不同油佐劑雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗免疫后新城疫HI抗體比較

圖2　不同油佐劑雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗免疫后禽流感HI抗體比較

由圖1可見，新城疫抗體B組最高、免疫后14 d抗體水平檢測合格，21 d后4種油佐劑的抗體均值分別為1∶74、1∶111、1∶26和1∶26，均達到合格標準，但C組和D組相對較低。

由圖2可見，禽流感抗體B組最高、免疫后14 d抗體水平檢測合格，21 d后4種油佐劑的抗體均值分別為1∶891、1∶2353、1∶446和1∶1552。通過對比不同時間的抗體水平，以T1為佐劑的B組滅活疫苗抗體水平最高，D組次之，A組和C組雖然符合國家標準，但抗體水平較低。

3小結與討論

免疫佐劑是指與抗原同時或先于抗原使用，能增強機體針對抗原的免疫應答能力或改變免疫反應類型的物質(zhì)[6]。選擇佐劑時不僅要考慮其免疫促進作用，也要兼顧佐劑的安全性及佐劑與抗原適當比例配制后疫苗的黏度、穩(wěn)定性等是否符合要求。

目前，滅活疫苗尤其是禽用滅活疫苗，通常使用的佐劑是礦物油佐劑，抗體滴度維持時間較長。但是，不同油佐劑對疫苗免疫效果的增強作用可能存在差異[7-8]，本試驗選擇了4種進口油佐劑，分別與雞新城疫和禽流感(H9亞型)病毒液配制成滅活疫苗，免疫接種適齡的SPF雞均未出現(xiàn)局部腫塊及不良反應，說明4種佐劑的生物兼容性較好，易吸收，無毒副作用。

經(jīng)試驗，4種進口油佐劑配制的雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗免疫適齡的SPF雞進行效力檢驗結果顯示，不同佐劑制備二價滅活疫苗的抗體效價確實存在明顯差異，只有T1作為佐劑的疫苗，免疫后2周抗新城疫病毒和流感病毒的抗體均可達到合格水平，其余佐劑則在免疫3周后才能達到合格水平。筆者認為T1白油是雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗的理想佐劑。

通過對不同佐劑的篩選來提高現(xiàn)有滅活疫苗的抗體水平和免疫保護效果具有重要的現(xiàn)實意義，以T1為佐劑的雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗的實際應用效果有待進一步驗證試驗。

參考文獻

[1]蔡寶祥.家畜傳染病學[M].北京.中國農(nóng)業(yè)出版社，1980:352.

[2]戚中田.禽流感病毒與人類禽流感[J].中國科學基金，2004,2:68-71.

[3]王學艷. NDV分離株F及HN基因的遺傳變異分析與核酸疫苗質(zhì)粒的構建[D]. 西北農(nóng)林科技大學,2008.

[4]李呈軍. 中國H9N2亞型禽流感病毒進化分析與H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗的研究[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學院,2005.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:21-22.

[6]高澤乾，孫建男，武煒，等.獸用免疫佐劑研究進展[J].唐山師范學院學報，2012,34(2):45-51.

[7]叢秋實,胡瑞鴻,鄭德富,鄭孝輝,姜麗萍.禽流感(H9)滅活疫苗白油佐劑的優(yōu)選試驗[J]. 中國動物保健,2013(10)：10-12.

[8]施建春,楊惠萍,. 不同佐劑的新城疫疫苗免疫效果的研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2014(6)：23-25.

中圖分類號：S858.31

文獻標識碼：A

文章編號：1005-7307(2015)06-0001-003

收稿日期：2015-09-18