張悅怡，趙 巖，劉勇慧，溫 馨，程 銘，盛彥玲，楊 鶴，劉雙利，張連學

(吉林農(nóng)業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春 130118)

五味子種子木脂素超聲提取工藝的優(yōu)化

張悅怡，趙 巖，劉勇慧，溫 馨，程 銘，盛彥玲，楊 鶴，劉雙利，張連學

(吉林農(nóng)業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春 130118)

【目的】 研究乙醇體積分數(shù)、超聲時間、液固比及其交互作用對五味子種子木脂素提取率的影響，并優(yōu)化其提取工藝?！痉椒ā?以木脂素提取率為考察指標，選取乙醇體積分數(shù)、超聲波提取時間和液固比為因素，進行單因素試驗；然后在單因素試驗基礎上確定因素和水平進行中心組合設計試驗，應用SAS 9.1軟件和響應面分析相結合的方法，模擬木脂素提取率回歸方程的預測模型，驗證優(yōu)化得到的最佳提取條件?！窘Y果】 五味子種子木脂素的優(yōu)化提取工藝為：乙醇體積分數(shù)73%，超聲時間32 min，液固比299 mL/g。在此條件下，經(jīng)過多次驗證試驗，發(fā)現(xiàn)木脂素提取率為2.47%，與理論值(2.59%)十分接近?！窘Y論】 利用中心組合設計試驗優(yōu)化獲得了五味子種子木脂素的超聲提取工藝，為其工業(yè)化提取提供了參考。

五味子；木脂素；提取工藝；中心組合設計；響應面分析

五味子為木蘭科植物五味子(Schisandrachinesnsis)的干燥成熟果實，俗稱北五味子，其味酸甘、性溫，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，五味子有保肝益腎、保護心腦血管、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、抗衰老、抗腫瘤、降血糖及免疫增強作用[2-3]。大量研究證明，五味子中含有的聯(lián)苯環(huán)辛二烯結構的木脂素類物質(zhì)是其主要的生物活性成分，主要包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素等[4]，其中含量較高的是五味子醇甲和五味子乙素[5]，此類物質(zhì)具有保肝、降酶、保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗艾滋病毒和抗癌等多種活性[6-11]。

目前，關于五味子木脂素的提取研究，多是以整個果實作為提取原料[12-16]，但五味子果實不同部位(果肉、種子)所含化學成分有別，導致其用途不同，如其果肉主要有效成分以有機酸、多酚類物質(zhì)為主，而種子以木脂素類成分為主；果肉可以用作飲品的生產(chǎn)原料，種子則可以用作木脂素類成分生產(chǎn)的原料[6]。所以，本研究將成熟五味子果肉與種子分離，僅以其種子為原料提取木脂素類成分，考察不同因素對木脂素類成分提取率的影響，并采用中心組合設計-響應面分析法對其超聲提取工藝進行優(yōu)化，以期提供一種高效、安全、無有毒溶劑殘留的五味子木脂素提取工藝，為五味子木脂素類物質(zhì)的工業(yè)化提取提供支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試五味子購于當?shù)厮幉氖袌?，?jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學張連學教授鑒定為木蘭科植物五味子的成熟果實，將果肉和種子分離，陰干，分別粉碎，過孔徑 0.30 mm篩后備用。

五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素對照品，購于上海源葉生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

所用儀器有KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、百靈LA114型電子天平(常熟市百靈天平儀器有限公司)和CXTH-3000高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 對照品溶液的制備 取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL分別含0.04 mg五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素的對照溶液，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 取同一批次的五味子種子粉末0.5 g，精密稱定，按試驗設定的液固比加入乙醇-水溶液，按設定時間超聲提取后，過濾，作為供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：大連江申分離科學技術公司C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃。流動相A為甲醇，B為水溶液，梯度洗脫條件為：0～4 min，流動相A 70%，流動相B 30%；4～12 min，流動相A 70%～65%，流動相B 30%～35%；12～18 min，流動相A 65%～100%，流動相B 35%～0。流速：1.0 mL/min。檢測波長：250 nm。

1.2.4 木脂素含量的測定 分別吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，采用外標一點法計算木脂素提取率。計算公式為：

式中：ρ為供試品質(zhì)量濃度(mg/mL)，v為供試品體積(μL)，D為稀釋倍數(shù)，m為供試品的質(zhì)量(g)。

1.3 試驗設計

1.3.1 單因素試驗 根據(jù)預試驗結果，以超聲提取的乙醇體積分數(shù)、提取時間、液固比進行單因素試驗，分別考察3個因素對木脂素提取率的影響。

(1)乙醇體積分數(shù)的影響。固定超聲提取時間為10 min，液固比為40 mL/g，乙醇體積分數(shù)分別為30%，50%，70%，95%，考察其對五味子種子木脂素提取率的影響。

(2)提取時間的影響。固定乙醇體積分數(shù)為70%，液固比為40 mL/g，超聲提取時間分別為10，20，30，60 min，考察其對五味子種子木脂素提取率的影響。

(3)液固比的影響。固定乙醇體積分數(shù)為70%，超聲提取時間為10 min，液固比分別為10，20，40，80 mL/g，考察其對五味子種子木脂素提取率的影響。

1.3.2 中心組合設計試驗 為了分析各因素及其交互作用對木脂素提取率的影響，以獲得最佳的提取工藝，在單因素試驗結果的基礎上，以五味子木脂素提取率為考察指標，進行中心組合設計試驗。中心組合設計試驗的因素及水平見表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SAS 9.1軟件對試驗結果進行響應面分析，建立數(shù)學模型，用脊嶺分析優(yōu)化試驗工藝，并采用ORIGIN 8.0軟件進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 五味子種子木脂素提取的單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)的影響 由圖1可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，五味子種子木脂素提取率呈先升高后降低趨勢，且于乙醇體積分數(shù)為70%時達到最高?？紤]到實際生產(chǎn)中乙醇回收的耗能問題，應盡可能選擇高體積分數(shù)乙醇進行提取，因此將乙醇體積分數(shù)考察范圍定為50%～95%。

2.1.2 超聲提取時間的影響 由圖2可知，超聲提取10 min時，五味子種子木脂素的提取率最高，隨后提取率迅速下降，至20 min降為最低；超聲提取20～60 min，提取率又逐漸升高?？紤]到各因素間可能存在的交互作用，防止漏掉最佳提取時間點，故將超聲提取時間的考察范圍定為0～60 min。

圖1 乙醇體積分數(shù)對五味子種子木脂素提取的影響
Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction of lignans fromSchisandraeseeds

2.1.3 液固比的影響 由圖3可知，隨著液固比的增加，五味子種子木脂素提取率隨之提高。當液固比為10～20 mL/g時提取率增加較快；當液固比為20～40 mL/g時有所降低，此后提取率又隨液固比的增加緩慢增大。為防止漏掉最佳提取的液固比條件，將液固比考察范圍定為10～300 mL/g。

2.2 五味子種子木脂素提取的中心組合設計試驗

采用SAS 9.1軟件的RSREG(二次響應面回歸模型)程序?qū)χ行慕M合設計試驗結果(表2)進行響應面分析，經(jīng)二次回歸擬合，得到回歸模型參數(shù)估計值見表3，方差分析結果見表4，脊嶺回歸分析結果見表5。

由表3可知，回歸方程為：

Y=0.007 132+0.023 703x1+0.032 202x2-

0.000 003 247x1x3+0.000 005 703x2x3+

從表4可以看出，總模型的復相關系數(shù)R2=0.741 6，表明回歸方程對木脂素提取率的預測值與實測值有較好的相關性。

脊嶺回歸分析結果(表5)表明，回歸方程預測的五味子種子木脂素提取的最佳條件為：乙醇體積分數(shù)73%、超聲提取時間32 min、液固比299 mL/g；在該條件下，木脂素的提取率為2.59%。驗證試驗發(fā)現(xiàn)，在上述條件下，五味子種子木脂素的平均提取率為2.47%，試驗值與預測值擬合良好，進一步說明模型預測的可行性。

為了更直觀地反映各因素對提取率的影響，運用ORIGIN 8.0軟件繪制了響應面圖，即木脂素提取率(Y)及對應的乙醇體積分數(shù)(x1)、超聲提取時間(x2)、液固比(x3)構成的三維空間圖形，結果見圖4～6。

圖4～6直觀地反映了乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間及液固比3個因素兩兩交互作用對響應值的影響，但基于價格、能耗等因素，本研究中乙醇體積分數(shù)的最大值為95%、超聲提取時間最長為60 min、液固比最高為300 mL/g，并未能全部達到極值。另由于各因素之間交互作用的影響，不能一味地將某一因素最大化而不考慮其他因素。由圖4～6 可以看出，五味子種子木脂素提取的較優(yōu)提取工藝范圍為：乙醇體積分數(shù)為65%～95%，超聲提取時間為20～40 min，液固比為100～300 mL/g，脊嶺回歸分析得到的結果均在此范圍內(nèi)，說明所得優(yōu)化工藝可行。

3 結論與討論

與其他傳統(tǒng)提取方法，如冷浸法、回流法相比，超聲提取法具有提取效率高、耗能少等優(yōu)點，而且為純物理方法，在提取過程中藥材一般不發(fā)生化學變化。本研究在單因素試驗基礎上，通過中心組合設計-響應面分析，建立了超聲輔助提取五味子種子木脂素的數(shù)學模型，回歸方程的復相關系數(shù)為0.741 6，說明方程擬合良好。

通過分析得到超聲提取五味子種子木脂素的最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)73%，超聲提取時間32 min，液固比299 mL/g。在此條件下，經(jīng)多次驗證，五味子種子木脂素提取率為2.47%，與理論值(2.59%)十分接近，說明所建立的預測模型可行，這為從五味子種子中大規(guī)模提取木脂素提供了可能。

[1] 田 洋.五味子有效成分提取工藝研究進展 [J].農(nóng)業(yè)科技與裝備,2011(5):29-30.

Tian Y.Research on extraction process of effective components inSchisandrachinenesis[J].Agricultural Science & Technology and Equipment,2011(5):29-30.(in Chinese)

[2] Panossian A,Wikman G.Pharmacology ofSchisandrachinensisBail.:An overview of Russian research and uses in medicine [J].Journal of Ethnopharmacology，2008,118(2)：183-212．

[3] 史 琳,王志成,馮敘橋.五味子化學成分及藥理作用的研究進展 [J].藥物評價研究,2011,34(3):208-212.

Shi L,Wang Z C,Feng X Q.Advances in studies on chemical constituents and pharmacological activities ofSchisandraechinensis[J].Drug Evaluation Research,2011,34(3):208-212.(in Chinese)

[4] 陳業(yè)高,秦國偉,謝毓元.五味子科植物的木脂素成分 [J].武漢植物學研究,2001,19(2):158-168.

Chen Y G,Qin G W,Xie Y Y.Lignans from plants ofSchisandraceae[J].Journal of Wuhan Botanical Research,2001,19(2):158-168.(in Chinese)

[5] 丁 佐,魯巍巍,李宏博,等．HPLC 同時測定北五味子中5 種木脂素的含量 [J].中國中藥雜志，2010，35(13):1728-1730．

Ding Z,Lu W W,Li H B,et al.Simultaneous determination of five kinds of lignans inSchisandrachinensis(Turcz.) Baill in HPLC [J].China Journal of Chinese Materia Medica,2010，35 (13):1728-1730．(in Chinese)

[6] 栗 爽,王 冰.HPLC法測定不同產(chǎn)地五味子種子中3種木脂素類含量 [J].江西中醫(yī)藥,2009,40(1):58-59.

Li S,Wang B.Determination of three kinds of lignans inSchisandrachinensisfrom different habitats by HPLC [J].Jiangxi Journal of Traditional Chinese Medicine,2009,40(1):58-59.(in Chinese)

[7] 胡俊揚,陸兔林,毛春芹,等.HPLC法同時測定不同產(chǎn)地五味子中8種木脂素類成分 [J].中成藥,2012,34(2):313-316.

Hu J Y,Lu T L,Mao C Q,et al.Simultaneous determination of eight lignans inSchisandrachinensisfrom different habitats by HPLC [J].Chinese Traditional Patent Medicine,2012,34(2):313-316.(in Chinese)

[8] 黃文倩,李 麗,肖永慶,等.HPLC同時測定五味子中6種木脂素類成分 [J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(10):63-66.

Huang W Q,Li L,Xiao Y Q,et al.Simultaneous determination of six lignans inSchisandrachinensisby HPLC [J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2011,17(10):63-66.(in Chinese)

[9] 王 蒙,劉紅耀,閆 明,等.五味子乙素逆轉膀胱腫瘤多藥耐藥的實驗研究 [J].中國醫(yī)療前沿,2010,23(5):28-29.

Wang M,Liu H Y,Yan M,et al.Reversal effect of SchB on bladder tumor multidrug resisitance [J].National Medical Frontiers of China,2010,23(5):28-29.(in Chinese)

[10] 李月珍,劉志新,趙富生,等.不同濃度五味子乙素對人胃癌細胞株MGC-803 增殖、凋亡的影響 [J].牡丹江醫(yī)學院學報,2010,31(4):1-5.

Li Y Z,Liu Z X,Zhao F S,et al.Effects of the different concentrationSchisandrinB inducing multiplication and apoptosis on human gastric cancer cell line MGC-803 [J].Journal of Mudanjiang Medical University,2010,31(4):1-5.(in Chinese)

[11] 李 玲,胡 汛,潘鏘榮,等.五味子乙素對 MRP 介導的腫瘤多藥耐藥逆轉作用的研究 [J].同濟大學學報:醫(yī)學版,2006,27(6):19-23.

Li L,Hu X,Pan Q R,et al.Study ofSchisandrinB on multidrug resistance reversal effect of MRP mediated tumor multidrug [J].Journal of Tongji University:Medical Science Edition,2006,27(6):19-23.(in Chinese)

[12] 可成友,邊 薔,康宏玲,等.北五味子中4種木脂素類化合物的高效液相色譜法同時測定 [J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(10):2523-2525.

Ke C Y,Bian Q,Kang H L,et al.Simultaneous determination of four lignans inSchisandrachinensis(Turcz.) Baill by HPLC [J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2010,21(10):2523-2525.(in Chinese)

[13] 張利康,陳海霞,焦 健.北五味子果實中化學成分的研究 [J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012(24):5-7.

Zhang L K,Chen H X,Jiao J.Chemical study on the fruit ofSchisandrachinesis(Turcz.) Baill [J].Natural Product Research and Development,2012(24):5-7.(in Chinese)

[14] 楊 磊,馬春慧,祖元剛.北五味子木脂素超聲提取工藝 [J].農(nóng)業(yè)工程學報,2009,25(1):185-192.

Yang L,Ma C H,Zu Y G.Technology for extracting lignans fromSchisandrachinesnsis(Turcz.) Baill by ultrasonic extraction [J].Transactions of the CSAE,2009,25(1):185-192.(in Chinese)

[15] 曹麗萍.五味子木脂素提取方法研究 [J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2011,13(1):185-187.

Cao L P.Advances on the extraction technologies of efficient components inSchisandrachinensis(Turcz.) Baill [J].Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,2011,13(1):185-187.(in Chinese)

[16] 程 敏,王 璐,宋小妹.HPLC法測定五味子品種中木脂素含量 [J].西北大學學報,2011,41(3):459-462.

Cheng M,Wang L,Song X M.Determination of lignan content inSchisandrachinensisby HPLC [J].Journal of Northwest University,2011,41(3):459-462.(in Chinese)

Optimization of lignans extraction technique fromSchisandrachinensisby supersonic wave

ZHANG Yue-yi,ZHAO Yan,LIU Yong-hui,WEN Xin,CHENG Ming,SHENG Yan-ling,YANG He,LIU Shuang-li,ZHANG Lian-xue

(CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 This study investigated the effects of ethanol concentration,ultrasonic extraction time,liquid to solid ratio and their interaction on extraction rate of lignans fromSchisandrachinensisand optimized the extraction technique.【Method】 Using lignans extraction rate as examining index,ethanol concentration,ultrasonic extraction time and solid to liquid ratio as factors,single factor experiment was carried out.Then,central composite design experiment was carried out based on the determined factors and levels.SAS 9.1 and response surface analysis were used to establish the regression model and the optimal ultrasonic extraction conditions were achieved.【Result】 The optimal conditions were:ethanol concentration 73%,ultrasonic extraction time 32 min,and liquid to solid ratio 299 mL/g.The extraction yield of lignans was 2.47%,which was close to the theoretical value of 2.59%. 【Conclusion】 The optimization extraction conditions for lignans from schisandrae seeds were obtained.

Schisandrachinensis;lignan;extraction technique;central composite design;response surface analysis

2013-12-11

國家科技支撐計劃項目(2011BAI03B01)；國家公益性行業(yè)科研專項(201303111)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20126046)；吉林省產(chǎn)業(yè)技術體系項目(201218)；吉林省中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(YYZX201258)

張悅怡(1990-)，女，吉林長春人，碩士，主要從事天然藥物化學成分與生物活性研究。 E-mail：cherishleforever@163.com

趙 巖(1979-)，男，吉林長春人，副教授，博士，主要從事天然藥物化學成分與生物活性研究。 E-mail：zhyjlu79@163.com

時間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.033

R284.2

A

1671-9387(2015)06-0215-06

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.033.html