何恒流,蔡宇良,高天翔,李 彬,宛 甜,王 玉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

陜西7個(gè)毛櫻桃自然居群遺傳多樣性的SSR評(píng)價(jià)

何恒流,蔡宇良,高天翔,李 彬,宛 甜,王 玉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 研究陜西野生毛櫻桃自然居群的遺傳多樣性，為科學(xué)保存和利用陜西野生毛櫻桃資源提供理論依據(jù)。【方法】 以陜西野生毛櫻桃的7個(gè)自然居群140份樣本為材料，用SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)果】 用10對(duì)SSR引物從7個(gè)毛櫻桃自然居群中共檢測(cè)出92個(gè)等位基因，各引物擴(kuò)增的條帶在6～14個(gè)。居群多態(tài)位點(diǎn)比率(PPL)為100%,Shannon’s 信息指數(shù)(I)平均值為1.280，Nei’s 基因多樣性指數(shù)(H)平均值為0.655，可觀察雜合度(Ho)平均值為0.584，期望雜合度(He)平均值為0.672，表明陜西7個(gè)毛櫻桃自然居群具有較高的遺傳多樣性水平。居群的基因分化系數(shù)Fst=0.181，表明陜西野生毛櫻桃的遺傳變異主要存在于居群(81.9%)內(nèi)，遺傳分化居群內(nèi)高于居群間，基于Fst測(cè)得基因流Nm為1.128。利用UPGMA對(duì)7個(gè)毛櫻桃自然野生居群進(jìn)行聚類，可以分為3類：麟游(LY)、繡房(XF)、華陰(HY)、哭泉(KQ)歸為第1類，小峪(XY)為第2類，鸚鴿(YG)和青化(QH)歸為第3類。【結(jié)論】 李屬植物SSR引物在毛櫻桃上能夠有效的轉(zhuǎn)移利用，陜西毛櫻桃自然居群具有較高的遺傳多樣性水平，其中華陰居群遺傳多樣性水平最高，遺傳分化居群內(nèi)高于居群間，7個(gè)居群可聚為3大類。

野生毛櫻桃；SSR；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)

根據(jù)中國(guó)植物志分類，毛櫻桃(Prunustomentosa,2n=16)隸屬薔薇科李屬櫻亞屬[1]，原產(chǎn)于中國(guó)，以野生為主，具有極強(qiáng)的抗寒性及較強(qiáng)的抗旱、抗瘠薄能力，毛櫻桃在園藝生產(chǎn)上已經(jīng)得到廣泛運(yùn)用。野生毛櫻桃在陜西山區(qū)廣泛分布，但果實(shí)風(fēng)味差異很大，有些還十分鮮美[2]。由于人為等因素的影響，一些山區(qū)的野生毛櫻桃資源瀕臨滅絕。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)研究陜西野生毛櫻桃種質(zhì)資源遺傳多樣性水平及居群遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)科學(xué)有效制定野生毛櫻桃資源保護(hù)策略、收集野生優(yōu)良毛櫻桃種質(zhì)資源、豐富和改良現(xiàn)有栽培品種都具有重要意義。

過(guò)去對(duì)于毛櫻桃的研究集中于形態(tài)、生理學(xué)等領(lǐng)域[3-4]，也有利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)部分地區(qū)毛櫻桃群體進(jìn)行研究的報(bào)道[5]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)信息含量高、重復(fù)性好和呈共顯性的特點(diǎn)，已被廣泛用于櫻亞屬植物居群的遺傳分析[6-8]。張琪靜[9]就北方5個(gè)省收集的44份毛櫻桃進(jìn)行SSR分析，驗(yàn)證了種與種之間引物的轉(zhuǎn)移利用，與近緣種聚類分析時(shí)，毛櫻桃獨(dú)自聚為一組。宛甜等[5]就秦嶺部分毛櫻桃居群做SSR分析，發(fā)現(xiàn)秦嶺毛櫻桃遺傳多樣性較為豐富。陜西野生毛櫻桃種質(zhì)資源豐富，對(duì)其居群比較全面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)陜西野生毛櫻桃7個(gè)居群140份毛櫻桃材料進(jìn)行了遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)分析，以期充分了解陜西野生毛櫻桃居群的種質(zhì)資源信息，為中國(guó)野生毛櫻桃資源的有效保存和合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2013年5-7月，根據(jù)國(guó)內(nèi)有關(guān)植物標(biāo)本館(室)記載，以及走訪地方有關(guān)研究人員了解相關(guān)資料后，在陜西省選取7個(gè)具有代表性的地點(diǎn)對(duì)野生毛櫻桃資源的生存現(xiàn)狀進(jìn)行了野外調(diào)查，根據(jù)自然居群現(xiàn)有分布規(guī)模對(duì)每個(gè)居群以“株”為單位隨機(jī)取樣，樣本間距離大于50 m，采集幼葉立即放入裝有干燥硅膠的自封塑料袋中干燥、備用。采集樣本共140份歸屬7個(gè)居群，詳見(jiàn)表1。

1.2 DNA提取和SSR-PCR

樣本DNA提取采用改進(jìn)的3×CTAB 提取法[10]，利用紫外分光光度計(jì)和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和品質(zhì)，稀釋至40 ng/μL,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

SSR-PCR反應(yīng)體系共10 μL,包含0.2 mmol/L引物0.6 μL，30～60 ng DNA 模板，5 μL PCR MIX混合液(康維公司)。其反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 30 s，58～54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，8 ℃保存。

本試驗(yàn)所選擇的120對(duì)SSR引物選自在李屬的櫻桃、桃、李和杏上已見(jiàn)報(bào)道[11-18]的引物，根據(jù)居群規(guī)模從7個(gè)居群中隨機(jī)取樣 20 份用于引物篩選，通過(guò)SSR-PCR擴(kuò)增，最終選出了條帶清晰、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的10對(duì)引物(表2)，以對(duì)140份毛櫻桃材料進(jìn)行進(jìn)一步分析。將所有材料的擴(kuò)增產(chǎn)物(2 μL)在1×TBE緩沖液中于恒定功率(50 W)下，用12%聚丙烯酰胺凝膠分離2 h，終止電泳，銀染顯色，照相保存。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)擴(kuò)增片段分子量大小對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行條帶分析，所得擴(kuò)增片段純合子記為“AA或BB”，雜合子記為“AB”[19]。所得數(shù)據(jù)用POPGENE32軟件進(jìn)行分析，獲得可用于評(píng)價(jià)居群遺傳多樣性的指標(biāo)，包括多態(tài)位點(diǎn)比率(PPL)、可觀察等位基因數(shù)(A)、有效等位基因數(shù)(Ae)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、可觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)；以及反映居群遺傳結(jié)構(gòu)的指標(biāo)，包括萊特固定指數(shù)(Fis)、種群間基因分化系數(shù)(Fst)、基因流(Nm)、遺傳相似度(GI)、Nei’s遺傳距離(GD)等。根據(jù)遺傳相似度和Nei’s遺傳距離，采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，并且在Nei’s遺傳距離的基礎(chǔ)上繪制居群聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物對(duì)陜西7個(gè)毛櫻桃居群的擴(kuò)增結(jié)果

從120對(duì)引物中共篩選出10對(duì)條帶清晰、重復(fù)性好的引物，各引物擴(kuò)增所得可觀察等位基因數(shù)為6～14(表2)，均有豐富擴(kuò)增。引物篩選結(jié)果顯示，來(lái)自桃的引物轉(zhuǎn)移率最高，達(dá)35%，來(lái)自李的引物轉(zhuǎn)移率最低，為15%。圖1為引物Pchcms4在華陰居群上的擴(kuò)增電泳結(jié)果。

圖1 引物Pchcms4對(duì)華陰毛櫻桃居群的擴(kuò)增產(chǎn)物
M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量;1～20.華陰居群(HY)1～20號(hào)單株
Fig.1 Amplified products of Huayin population ofPrunustomentosausing primer Pchcms4
M.50 bp DNA Marker;1-20.The samples of Huayin population(HY)

2.2 陜西7個(gè)毛櫻桃居群的遺傳多樣性

由表3可知，10對(duì)引物在陜西7個(gè)毛櫻桃居群間擴(kuò)增豐富，各居群多態(tài)位點(diǎn)比率為100%。在居群水平上，可觀察等位基因數(shù)(A)、有效等位基因數(shù)(Ae)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)均值分別為4.929，3.340，1.280和0.655。Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)是衡量居群遺傳多樣性最常用的指標(biāo),據(jù)此可知陜西7個(gè)毛櫻桃居群遺傳多樣性水平從大到小依次為HY>KQ>XY>XF>QH>YG>LY。

2.3 陜西7個(gè)毛櫻桃居群的遺傳結(jié)構(gòu)

由表4可知，陜西7個(gè)毛櫻桃自然居群的種群間基因分化系數(shù)(Fst)為0.104～0.236，居群間的平均基因分化系數(shù)為0.181，這說(shuō)明毛櫻桃居群81.9%的遺傳分化存在于居群內(nèi)，18.1%的遺傳分化存在于居群間，表明陜西野生毛櫻桃遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。基于Fst測(cè)得基因流(Nm)為1.128。由萊特固定指數(shù)(Fis)可知，除UDP96-008、UDP98-025、UCD-CH31為負(fù)值外，其他引物均為正值，說(shuō)明缺乏或存在過(guò)多的純合子。除UDP96-008、UDP97-403、UDP98-025位點(diǎn)外，居群在其他位點(diǎn)均偏離 Hardy-Weinberg 平衡(P< 0.05)，其表現(xiàn)為可觀察雜合度明顯低于期望雜合度。

2.4 陜西7個(gè)毛櫻桃居群的聚類結(jié)果

基于陜西7個(gè)毛櫻桃居群間的遺傳距離(表5)，采用 UPGMA 法進(jìn)行聚類分析，進(jìn)一步直觀分析居群間的遺傳關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在遺傳距離為0.6(圖中虛線所示位置)時(shí)，陜西7個(gè)毛櫻桃居群可歸為3大類：其中麟游(LY)、繡房(XF)、華陰(HY)與哭泉(KQ)居群歸為一類，小峪(XY)居群歸為第2類，鸚鴿(YG)和青化(QH)居群歸為第3類。由圖2還可看出，麟游(LY)與繡房(XF)居群的親緣關(guān)系最近，與青化(QH)居群的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

注：表中右上為遺傳相似度，左下為遺傳距離。

Note:Above diagonal is genetic identity while below diagonal is genetic distance.

3 討 論

3.1 SSR引物的擴(kuò)增

本試驗(yàn)從120對(duì)李屬植物引物中篩選出10對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定的引物，其中來(lái)自桃的引物表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)移率，達(dá)35%，而李的引物在毛櫻桃中表現(xiàn)出較低的轉(zhuǎn)移率，僅為15%，此研究結(jié)果與張琪靜[9]的研究結(jié)果相似。引物UDP96-001、UCD-CH31在陜西7個(gè)毛櫻桃居群上擴(kuò)增的可觀察等位基因數(shù)均高于其在土耳其野生甜櫻桃上的擴(kuò)增數(shù)(12∶6，9∶4)[20]。同樣是在毛櫻桃上，本研究中引物UDP96-001、UCD-CH31擴(kuò)增的可觀察等位基因數(shù)也比Zhang等[10]的研究結(jié)果略高(12∶5，9∶4)。黃磊等[21]認(rèn)為，引物擴(kuò)增情況與研究對(duì)象有關(guān)，并在一定范圍內(nèi)隨居群個(gè)體數(shù)增多，引物擴(kuò)增的可觀察等位基因數(shù)增加。

3.2 陜西毛櫻桃居群的遺傳多樣性

本研究比較全面地對(duì)陜西野生毛櫻桃居群進(jìn)行了遺傳多樣性分析。其Shannon’s 信息指數(shù)(I)平均為1.280，Nei’s 基因多樣性指數(shù)(H)平均為0.655，與近緣物種相比，高于同屬于李屬的杏[22]、馬哈利[23]以及同是薔薇科的新疆野蘋果[24]，表明陜西野生毛櫻桃居群的遺傳多樣性水平較高。秦偉等[25]認(rèn)為，新疆野生蘋果通過(guò)種子實(shí)生繁殖等一套固有的繁殖體系來(lái)維持種群的繁殖，從而保持了其較高的遺傳多樣性水平。毛櫻桃自花結(jié)實(shí)能力很強(qiáng)，以實(shí)生繁殖為主，供試7個(gè)居群材料豐富、分布廣泛，而且有些居群就位于秦嶺巴山的多樣性中心，這可能是導(dǎo)致陜西野生毛櫻桃居群遺傳多樣性水平較高的主要原因。

3.3 陜西毛櫻桃居群的遺傳結(jié)構(gòu)

居群遺傳結(jié)構(gòu)是遺傳變異在時(shí)間、空間上的分布式樣，是突變、基因流、選擇和遺傳漂變共同作用的結(jié)果，用來(lái)揭示居群內(nèi)部的分布格局。遺傳分化是反映遺傳結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。本研究中7個(gè)毛櫻桃居群的基因分化系數(shù)Fst=0.181，表明陜西野生毛櫻桃的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)(81.9%)，遺傳分化居群內(nèi)高于居群間。在對(duì)與毛櫻桃相近物種的相關(guān)研究中也有一致的結(jié)果[5，9]。基因流是影響居群遺傳分化的重要因素，Loveless等[26]認(rèn)為，當(dāng)居群間基因流大于1時(shí)，基因流起到均質(zhì)化作用。本研究中7個(gè)毛櫻桃居群的基因流Nm=1.128>1，表明基因流可能是引起毛櫻桃居群間遺傳分化的重要因素。對(duì)于野生毛櫻桃居群而言，由于各居群地理位置距離較遠(yuǎn)，導(dǎo)致居群的開花期不同，以及山脈的阻隔，都影響了毛櫻桃居群間的基因交流。蔡宇良[27]認(rèn)為，種子散布機(jī)制對(duì)居群間的遺傳分化有顯著影響，中國(guó)櫻桃主要依靠動(dòng)物消化系統(tǒng)傳播種子，其種子流受到動(dòng)物活動(dòng)范圍的制約。據(jù)此推測(cè)，在陜西山區(qū)復(fù)雜的地理環(huán)境下，以野生毛櫻桃果實(shí)為生的鳥獸可能是影響毛櫻桃居群遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素。

野生毛櫻桃資源在陜西山區(qū)雖然分布廣泛，但此次野外實(shí)地考察發(fā)現(xiàn)，此類野生資源遭受人為破壞的現(xiàn)象嚴(yán)重，部分地區(qū)的野生毛櫻桃資源瀕臨滅絕，因此有必要加強(qiáng)野生毛櫻桃資源的保護(hù)。本研究中7個(gè)居群的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)，而居群間遺傳分化系數(shù)較大，所以在重點(diǎn)保護(hù)遺傳多樣性豐富的野生居群時(shí)應(yīng)兼顧不同地理區(qū)域居群。在7個(gè)自然居群中，華陰(HY)居群遺傳多樣性水平最高，因此，在利用和保護(hù)陜西野生毛櫻桃種質(zhì)資源時(shí)，可以優(yōu)先考慮華陰(HY)居群。

4 結(jié) 論

利用10對(duì)SSR引物對(duì)陜西7個(gè)野生毛櫻桃自然居群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，李屬植物SSR引物在毛櫻桃上能夠有效的轉(zhuǎn)移利用，7個(gè)毛櫻桃自然居群的遺傳多樣性水平豐富，其中華陰居群遺傳多樣性最高，居群內(nèi)遺傳分化高于居群間。通過(guò)聚類分析，可將7個(gè)居群聚為3類。

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SSR evaluation of genetic diversity of seven wildPrunustomentosapopulations in Shaanxi

HE Heng-liu,CAI Yu-liang,GAO Tian-xiang,LI Bin,WAN Tian,WANG Yu

(CollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study investigated the genetic diversity of wildPrunustomentosapopulations to provide theoretic reference for utilization and conservation of thus resources in Shaanxi.【Method】 A total of 140 samples from seven wildPrunustomentosapopulations in Shaanxi were collected to study genetic diversity and genetic structure using SSR markers.【Result】 A total of 92 alleles of 10 loci were detected from seven wildPrunustomentosapopulations and the number of alleles per locus ranged from 6 to 14.The percentage of polymorphic loci (PPL) was 100% in populations.The mean Shannon’s information index (I),Nei’s gene diversity (H),observed heterozygosity (Ho),and expected heterozygosity (He)were 1.280,0.655,0.584 and 0.672,respectively.The results revealed that the genetic diversity in the wildPrunustomentosaof the 7 populations in Shaanxi was rich. About 81.9% of (Fst=0.181) gene differentiation was observed within the populations,higher than among populations.According to gene differentiation coefficient,the gene flow (Nm) was 1.128.Based on un-weighted pair-group method, the seven wildPrunustomentosapopulations in Shaanxi were divided into three groups:group one included LY,XF,HY,and KQ,group two included XY,and group three contained YG and QH.【Conclusion】 Genetic diversity in the wildPrunustomentosain Shaanxi was rich,and that of HY population was the richest.The genetic differentiation within each population was higher than among populations.And the 7 populations were divided into 3 groups.

Prunustomentosa;SSR;genetic diversity;genetic structure

2014-07-11

“十二五”國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD02B00)；唐仲英果樹育種基金項(xiàng)目(2009YZ033)

何恒流(1989-)，男，安徽合肥人，在讀碩士，主要從事櫻桃育種與種質(zhì)資源研究。E-mail:526610925@qq.com

蔡宇良(1964-)，男，陜西寶雞人，教授，主要從事果樹育種與栽培研究。E-mail:cylxlcz0673@sina.com

時(shí)間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.021

S662.501

A

1671-9387(2015)06-0193-06

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