宋 爽，崔 培，王堯堯，蔣書東，章孝榮，方富貴，李福寶

(安徽農業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

神經激肽B在大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸上的表達

宋 爽，崔 培，王堯堯，蔣書東，章孝榮，方富貴，李福寶

(安徽農業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

【目的】 探究初情期啟動前、啟動中、啟動后大鼠下丘腦、垂體和卵巢中神經激肽B(Neurokinin B，NKB)的表達變化?！痉椒ā?以SD雌性大鼠為研究對象，分別取大鼠的下丘腦、垂體和卵巢組織制作冰凍切片，運用免疫熒光染色法檢測SD大鼠下丘腦、垂體和卵巢上NKB的分布?！窘Y果】 NKB主要分布于各時期大鼠下丘腦的弓狀核、腹內側核、室旁核、腺垂體以及卵巢的黃體細胞、間質細胞。但NKB在不同時期表達水平不同，在初情期啟動前(出生后25 d)和啟動后(出生后60 d)表達最強，在初情期啟動中最弱(P<0.05)。同一時期不同核團之間NKB表達水平也不同，初情期啟動前和啟動中室旁核最強，弓狀核次之，腹內側核最弱(P<0.05)；在初情期啟動后，弓狀核和腹內側核中NKB的表達顯著高于室旁核(P<0.05)。腺垂體中NKB在初情期啟動時表達最強，初情期啟動前次之，初情期啟動后最弱(P<0.05)。卵巢間質細胞中NKB在初情期啟動中的表達顯著低于初情期啟動前、后(P<0.05)。卵巢黃體細胞中NKB在初情期啟動后表達最強，初情期啟動時最弱?！窘Y論】 NKB可能與初情期啟動的調控密切相關。

神經激肽B；初情期啟動；大鼠；下丘腦；垂體；卵巢

神經激肽B(Neurokinin B，NKB)又名神經介素K(Neurokinin K)，是速激肽家族(Tachykinin family)的一員[1]。NKB是Kimura等于1983年首先從豬脊髓中分離出來的含有10個氨基酸的多肽[2]。速激肽家族主要由P物質(SP)、神經激肽A(K物質)和NKB組成。Amstalden等[3]通過對IHH患者進行遺傳學分析發(fā)現，NKB及其受體參與生殖調控。

初情期的啟動是動物獲得繁殖能力的標志，初情期啟動始于下丘腦促性腺激素釋放激素(Gonadotropin releasinghormone，GnRH)脈沖式分泌的提高。研究顯示，動物胚胎早期GnRH神經元有活化跡象，隨后進入休眠狀態(tài)，直至初情期啟動才再次活化[4]。應用免疫細胞化學法結合腹腔注射熒光逆行示蹤技術,可觀察到GnRH神經元纖維束在大鼠下丘腦正中隆起處與NKB免疫陽性纖維密切交織，且GnRH神經元軸突表達NKB受體NK3R[5]，提示NKB可能參與GnRH神經元的再次活化，從而啟動初情期。

目前關于NKB在大鼠[5]、綿羊[6]、猴子[7]、山羊[8]、小鼠[9]等動物生殖軸上分布的報道較多，但大多數僅涉及生殖軸中的某一個或幾個部分的組織、器官。另外，關于生殖軸上NKB的分布及表達量仍存在爭議，缺少對生殖軸整體的研究，而關于初情期啟動前后動物生殖軸上NKB的表達變化更是鮮有報道。本試驗運用免疫熒光技術對大鼠初情期啟動前、啟動中、啟動后生殖軸上NKB的分布及表達變化進行了研究，旨在為NKB在初情期啟動中的調控作用研究提供形態(tài)學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

處于發(fā)情周期不同階段的SD雌性大鼠15只，其中初情期啟動前(出生后25 d)、初情期啟動中(陰門開啟)、初情期啟動后(出生后60 d)[10]各5只。

1.2 采樣及切片制作

麻醉處死大鼠，取下丘腦、垂體、卵巢，放入已準備好的體積分數4%的多聚甲醛固定液中，固定12～24 h后取出，經0.1 mol/L PBS充分洗滌后，置于4 ℃的0.3 g/mL蔗糖溶液中直至組織沉底，隨即制備冰凍切片，其中下丘腦切片厚度25 μm，垂體和卵巢均為8 μm。將冰凍切片放入盛有0.01 mol/L PBS(pH 7.4)的6孔板中待用。

1.3 切片的免疫熒光染色

將切片用鉤環(huán)撈入24孔板用于免疫熒光染色。切片用PBS浸洗3次，每次10 min，用體積分數1% Triton(V(Triton)∶V(PBS)=1∶99)孵育10～20 min，用0.1 g/mL牛血清白蛋白封閉15 min，甩去封閉液，加入NKB一抗 (羊抗鼠NKB，SANTA CRUZ，編號sc-14109，稀釋倍數1∶200)，置于濕盒內4 ℃孵育過夜。過夜孵育的切片用PBS洗3次，每次10 min，加入二抗IgGtR(用tR標記的兔抗山羊IgG，SANTA CRUZ，編號sc-2780，稀釋倍數1∶200)，室溫下避光孵育2 h， PBS 洗3次，每次10 min， DAPI染核2 min，避光條件下用PBS 洗3次，每次5 min，將組織切片置于滴有甘油的載玻片上，蓋上蓋玻片即可在顯微鏡下觀察。最后將組織切片展貼于載玻片上。試驗設置陰性對照組，一抗用PBS替代，其他步驟相同。

1.4 圖像采集及分析

甘油封片后置于熒光顯微鏡(OLYMPUS DP72，奧林巴斯)下觀察，然后拍照。運用Image-pro plus 6.0軟件對陽性區(qū)域平均光密度值(Density mean)進行分析。平均光密度值用“平均值±標準差”表示，采用t檢驗分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 NKB在初情期啟動前后大鼠下丘腦中的表達

免疫熒光顯示，NKB免疫反應陽性細胞在熒光顯微鏡下有橙紅色熒光，陰性對照組無熒光。不同發(fā)育時期所有大鼠下丘腦的弓狀核、腹內側核、室旁核均有NKB表達(圖1)。由表1可知，不同時期的同一核團平均光密度值不同。初情期啟動中，NKB在各個核團上的表達顯著低于初情期啟動前(P<0.05)；在弓狀核和室旁核的表達顯著高于初情期啟動后(P<0.05)，在腹內側核的表達顯著低于初情期啟動后(P<0.05)；在弓狀核和室旁核，初情期啟動前(出生后25 d)和啟動后(出生后60 d)NKB的表達差異不顯著(P>0.05)，而在腹內側核初情期啟動前和啟動后差異顯著(P<0.05)。同一時期不同核團平均光密度值也不同，初情期啟動前和啟動中，NKB在大鼠下丘腦室旁核中表達最強(P<0.05)，弓狀核次之，腹內側核最弱；初情期啟動后NKB在大鼠下丘腦弓狀核和腹內側核中的表達顯著高于室旁核(P<0.05)。

注：同行數據后標不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同列數據后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different capital letters indicate significant difference in each row (P<0.05),different small letters indicate significant difference in each column (P<0.05).

2.2 NKB在初情期啟動前后大鼠垂體中的表達

免疫熒光結果顯示，陰性對照組無熒光；由表2可知，初情期啟動前后大鼠腺垂體中均有NKB表達(圖2)，但不同時期的表達強度不同。初情期啟動中NKB在腺垂體中的表達水平顯著高于初情期啟動前和啟動后(P<0.05)，而在初情期啟動前和啟動后NKB的表達強度之間無顯著差異(P>0.05)(表2)。

注：同列數據后標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，“-”表示無NKB表達。

Note:Different letters in each column mean significant difference(P<0.05).“-” shows no NKB expression.

2.3 NKB在初情期啟動前后大鼠卵巢中的表達

NKB在初情期啟動前后大鼠卵巢中的表達見圖3。免疫熒光染色結果顯示，陰性對照組無熒光。NKB在各個時期大鼠卵巢間質細胞中均有表達，而在黃體細胞中只表達于初情期啟動中和初情期啟動后(圖3)。由表2可知，初情期啟動中在卵巢間質細胞中NKB表達水平顯著低于初情期啟動前和啟動后(P<0.05)；且初情期啟動前NKB在卵巢間質細胞中的表達強度顯著高于初情期啟動后(P<0.05)；在初情期啟動中，卵巢黃體細胞中NKB表達程度顯著低于初情期啟動后(P<0.05)。

3 討 論

雌性動物的生殖機能受下丘腦-垂體-卵巢軸的調控，且有多種神經遞質共同參與，其中GnRH脈沖式分泌的激活是啟動青春期的關鍵。

本試驗結果表明，NKB主要分布于各時期大鼠下丘腦的弓狀核、室旁核和腹內側核。這與前人在小鼠[9]、大鼠[11]、猴子[12]、皖西白鵝[13]等動物上的定位研究結果部分相似。但與Navarro等[14]報道的大鼠下丘腦視上核存在NKB的研究結果不一致，這可能與抗體或者試驗動物品種不同有關。

下丘腦NKB所在核團與GnRH神經元所在的正中隆起等部位毗鄰。Seminara等[15]和Krajewski等[16]采用熒光逆行追蹤結合免疫熒光雙標記法研究發(fā)現，NKB神經纖維和GnRH神經纖維在正中隆起處交織，且該部位共存有NKB受體NK3R。下丘腦弓狀核是促性腺激素分泌的主要調控中心，弓狀核上有NKB神經元，則說明NKB和GnRH神經元可能存在結構和功能上的緊密關系。近期人類基因學研究發(fā)現，編碼NKB和其受體的基因功能缺失會導致促性腺激素分泌不足從而造成性腺功能減退甚至不育[3]，提示NKB可能是調控生殖的又一重要因子。Navarro等[9]研究認為，GPR54和NK3R激活對初情期前小鼠性腺軸的作用是一致的：給性腺切除小鼠腦室內注射NKB激動劑后發(fā)現kiss1神經元C-fos mRNA表達增加，而kiss1神經元具有促進GnRH分泌的作用[17]，被認為是初情期啟動的“看門人”[11]，可見NKB可能通過kiss1調控初情期啟動。García-Galiano等[18]報道TA3C基因位于kiss1神經元的上游，直接或間接作用于kiss1神經元以調節(jié)生殖功能。由此筆者認為，NKB可能在初情期啟動前、后直接參與對GnRH的調節(jié)作用，這與Navarro等[9]認為“NKB直接激活KNDy神經元隨后驅動GnRH神經元和促性腺激素分泌”的研究結果類似。此外，研究表明，大鼠GnRH分泌呈周期性變化，初情期啟動前分泌顯著增加，排卵前的分泌量最大，初情期啟動后次之，啟動中的分泌量最少[19]。

而本試驗發(fā)現，初情期啟動前、啟動后大鼠下丘腦各核團上NKB的表達量顯著高于初情期啟動中，這與GnRH的分泌規(guī)律存在一定相似處。初情期啟動前，機體內源性性腺激素水平驟降，低水平的性腺激素能夠負反饋刺激下丘腦分泌GnRH，而此時下丘腦的NKB表達量最高，Kauffman等[20]在卵巢摘除小鼠的試驗中也得到了相似的結論。提示下丘腦NKB可能參與性腺激素對GnRH的調控從而調控大鼠初情期的啟動。但是關于NKB到底是通過何種方式參與生殖調控以及在生殖調控中的路徑等問題還不甚明確，有待于進一步的研究。

本研究首次報道了NKB在大鼠垂體和卵巢上的定位分布。腦垂體是動物體內重要的內分泌腺，是調節(jié)機體生理平衡的總開關，在代謝、生長、發(fā)育和生殖等方面起著重要的調節(jié)作用。垂體分為神經垂體和腺垂體。其中腺垂體是內分泌系統(tǒng)的重要調控樞紐，受下丘腦釋放激素和靶腺激素的雙重調節(jié)[21]。已有的研究發(fā)現，下丘腦弓狀核上的NKB通過傳出神經元進入垂體門脈循環(huán)從而影響垂體前葉LH和FSH釋放[22]。Billings等[23]在母羊上發(fā)現，NKB可以促進LH分泌。且Ruiz-Pino等[24]研究表明，NKB受體激動劑對于雌性大鼠LH分泌有持續(xù)性的興奮作用，提示NKB可能通過腺垂體參與下丘腦-垂體-性腺軸的調控作用，進而影響促性腺激素的分泌。Mijiddorj等[25]于2012年發(fā)現NKB在腦垂體的GH3細胞系中參與促進催乳素的分泌。說明NKB可直接作用于腦垂體。本試驗結果表明，NKB主要在腺垂體上表達，神經垂體上未見分布。提示NKB可能直接作用于腺垂體調控生殖作用。

本試驗結果表明，NKB在各個時期大鼠卵巢間質細胞以及啟動中和啟動后大鼠黃體細胞中均有不同程度的表達。而卵巢間質細胞能夠合成雄激素，卵巢黃體細胞參與機體雌激素和孕激素的合成與分泌，提示NKB可能與性腺激素的合成和分泌有關。本研究結果表明，初情期啟動后大鼠卵巢黃體細胞上的NKB表達最強，初情期啟動中最弱。Rance等[26]研究發(fā)現，絕經婦女的弓狀核神經元肥大，NKB表達增加。切除卵巢的雌猴和鼠其下丘腦NKB表達亦增加，切除睪丸的動物也有同樣的現象發(fā)生[27-28]。另外，給予性腺切除的動物雌激素治療能夠抑制NKB表達，表明NKB表達增加是由于卵巢雌激素分泌減少造成的[27]。由此可見，高水平的雌激素不僅能夠抑制下丘腦NKB的表達，而且能夠下調卵巢上NKB的表達。Navarro等[27]也發(fā)現，NKB信號肽在雌性大鼠初情期啟動中呈弱陽性表達，提示NKB可能通過調節(jié)性腺激素的分泌從而參與機體生殖和發(fā)育過程。

綜上所述，NKB在雌性大鼠的下丘腦、腺垂體以及卵巢中均有不同程度的表達，且在初情期啟動前、后表達最強，揭示NKB可能在初情期啟動的過程中有重要的作用。有關NKB對初情期啟動以及對激素調節(jié)的作用機制還有待進一步的研究。

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Expression of Neurokinin B in hypothalamus,pituitary and ovary of rats

SONG Shuang,CUI Pei,WANG Yao-yao,JIANG Shu-dong, ZHANG Xiao-rong,FANG Fu-gui,LI Fu-bao

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 This study aimed to investigate the change in expression of Neurokinin B (NKB) in hypothalamus,pituitary and ovary of rats at prepuberty,puberty-onset and post puberty.【Method】 Females SD rats were selected and their hypothalamus,pituitary and ovary were taken for frozen section before immunofluorescence staining technology was used to detect the distribution of NKB in hypothalamus,pituitary and ovary.【Result】 NKB was mainly distributed in arcuate nucleus,ventromedial hypothalamic nucleus,paraventricular nucleus of the hypothalamic,adenohypophysis cells,and corpus luteum cells and stromal cells of ovary of rats.Expression intensity of NKB in hypothalamu was different at different periods with the strongest expression at prepuberty (on postnatal 25th day) and post puberty (on postnatal 60th day) (P<0.05) and the weakest at puberty-onset (P<0.05).Different nucles had different expression levels at the same time,at prepuberty and puberty-onset the strongest expression was found in the paraventricular nucleus followed by arcuate nucleus,while the weakest was in the ventromedial hypothalamic nucleus (P<0.05);while at post puberty,the strongest expression was found in arcuate nucleus and ventromedial hypothalamic nucleus,while the weakest expression was in the paraventricular nucleus.The strongest expression intensity of NKB in pituitary was found at puberty-onset,followed by prepuberty and post puberty (P<0.05).Expression intensity of NKB in stromal cells of ovary at puberty-onset was significantly lower than that at prepuberty and post puberty (P<0.05).The weakest expression intensity of NKB was found at puberty-onset,while the strongest expression was at post puberty in stromal cells of ovary.【Conclusion】 NKB may be closely related to the control of puberty onset.

NKB;puberty onset;rats;hypothalamus;pituitary;ovary

2014-01-01

高等學校博士學科點專項科研基金博導類資助課題(20123418110004)；安徽省自然科學基金項目(1208085MC39)

宋 爽(1986-)，女，河南南陽人，碩士，主要從事動物解剖與生殖內分泌研究。E-mail：shuangalice2011@163.com

李福寶(1953-)，男，安徽固鎮(zhèn)人，教授，主要從事動物解剖與生殖內分泌研究。E-mail:lfb@ahau.edu.cn

時間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.023

S852.1

A

1671-9387(2015)06-0007-08

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.023.html