侯霞霞，來(lái)航線，韋小敏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

青貯用乳酸菌的篩選及其生物學(xué)特性研究

侯霞霞，來(lái)航線，韋小敏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 篩選生長(zhǎng)繁殖快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)且耐酸的乳酸菌，以獲得制備果渣青貯發(fā)酵劑的優(yōu)良菌株?！痉椒ā?通過(guò)葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣特征、產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)曲線進(jìn)行供試乳酸菌的篩選，對(duì)篩選出的優(yōu)良菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，并進(jìn)一步研究其生長(zhǎng)溫度范圍、酸堿耐受性、耐鹽性，最后對(duì)菌株發(fā)酵液進(jìn)行酸度滴定和有機(jī)酸組分分析?！窘Y(jié)果】 經(jīng)篩選共獲得R7、R3、Rg和Re 4 株優(yōu)良乳酸菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA序列分析，確定R7為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，R3為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)，Rg為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，Re為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)。4 株菌均可在15～50 ℃生長(zhǎng)。菌株R7生長(zhǎng)最快，降酸能力最強(qiáng)，發(fā)酵液乳酸含量最高，占總酸含量的95.40%，在pH值3.0條件下可以旺盛繁殖，同時(shí)可耐受質(zhì)量濃度0.08 g/mL NaCl。Re、R3生長(zhǎng)及產(chǎn)酸僅次于R7，酸堿耐受性較強(qiáng)。Rg在50 ℃生長(zhǎng)良好，可耐受高溫?！窘Y(jié)論】 菌株R7、Re、R3、Rg具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、耐酸、產(chǎn)乳酸含量高等優(yōu)良生物學(xué)特性，可應(yīng)用于果渣青貯飼料添加劑的制備。

青貯發(fā)酵劑；乳酸菌；產(chǎn)酸能力

青貯飼料是反芻動(dòng)物重要的粗飼料來(lái)源，發(fā)展畜牧業(yè)的主要支撐。青貯飼料是在厭氧條件下利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，使青貯料pH值迅速下降，抑制其他耗氧微生物對(duì)青綠飼料營(yíng)養(yǎng)成分的分解作用，從而使青綠飼料得以保存[1]。許多試驗(yàn)表明，添加乳酸菌可降低青貯飼料pH和氨態(tài)氮含量，提高乳酸含量和飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2-6]。由于青貯原料表面乳酸菌的數(shù)量有限，同時(shí)又混有其他微生物，要使乳酸菌盡快繁殖，原料必須有超過(guò)105CFU/g的乳酸菌[7]。青貯過(guò)程中乳酸菌必須具備活力強(qiáng)且達(dá)到一定數(shù)量，才能更好地發(fā)揮其生物功效。因此，篩選出生長(zhǎng)繁殖快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的優(yōu)良乳酸菌菌株，是制備優(yōu)良青貯添加劑的核心，也是青貯成功的關(guān)鍵。

青貯飼料中含有豐富的乳酸菌，其中包括腸球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌、鏈球菌和乳桿菌等，它們?cè)谇噘A飼料發(fā)酵中起重要作用。目前用于青貯的發(fā)酵菌主要有同型發(fā)酵乳酸菌，如植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、糞鏈球菌(Enterococcusfaecium)、片球菌(Pediococcusspp)等，以及異型發(fā)酵乳酸菌，如布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)等。何軼群等[8]從玉米秸稈青貯飼料中篩選到 6 株產(chǎn)酸性和抑菌性較好的優(yōu)良乳酸菌，其中產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的是植物乳桿菌。段宇珩等[9]試驗(yàn)表明，青貯飼料中的大多數(shù)乳酸菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)，占總數(shù)的79%以上。劉飛等[10]從青貯飼料中篩選出了產(chǎn)酸性能較好的2株乳球菌和2株乳桿菌。張慧杰等[11]研究表明，適溫條件下乳酸桿菌的活力及生長(zhǎng)速度均優(yōu)于乳酸球菌，且篩選到 1 株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的植物乳桿菌。

果業(yè)加工業(yè)產(chǎn)生的大量果渣廢棄物極易腐敗，造成嚴(yán)重環(huán)境污染，但果渣中含有豐富的養(yǎng)分，可供乳酸菌生長(zhǎng)利用，可作為優(yōu)良的青貯原料。因此果渣青貯在變廢為寶的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了廢渣的零排放，具有重大的實(shí)際意義及應(yīng)用前景。然而目前，可以用作果渣青貯發(fā)酵劑的菌株研究很少，自然的青貯又不能保證青貯的品質(zhì)。因此，篩選可應(yīng)用于果渣青貯的優(yōu)良乳酸菌非常關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)供試乳酸菌生長(zhǎng)與產(chǎn)酸性能以及耐酸性指標(biāo)的測(cè)定，篩選適用于果渣青貯的優(yōu)良菌株，進(jìn)一步結(jié)合傳統(tǒng)鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)手段將篩選出的乳酸菌鑒定到種，旨在獲得生物學(xué)特性優(yōu)良的乳酸菌，以期為果渣青貯飼料乳酸菌添加劑的研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試乳酸菌共有9株，其中4株為西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物生態(tài)研究室篩選保藏，編號(hào)分別為R1、R7、R3、Rf，可作為飼用乳酸菌制劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用；5株為分離自青貯飼料的菌株，編號(hào)分別為Re、Rg、Rn、Rb、Rd。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基[12]，MRS瓊脂斜面培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡(Motic)、立式壓力蒸汽滅菌鍋、PCR 儀、Haier冰箱、凝膠成像儀、電泳儀、紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜儀(waters 2695)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的篩選 利用MRS液體培養(yǎng)基對(duì)9株供試菌株進(jìn)行活化，再進(jìn)行平板涂布，通過(guò)觀察菌落形態(tài)特征以及革蘭氏染色后鏡檢結(jié)果判斷菌株是否為純培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的桿狀或球狀菌株進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)。

葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣[12]：對(duì)供試菌株進(jìn)行產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中指示劑變黃表示產(chǎn)酸，由顏色深淺初步判斷菌株的產(chǎn)酸強(qiáng)弱。軟瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡或出現(xiàn)2%瓊脂層向上頂?shù)默F(xiàn)象表示產(chǎn)氣。

產(chǎn)酸速率：按1.0×107CFU/mL的接種量將供試乳酸菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)。每隔2 h采用DELTA-320 pH計(jì)測(cè)定各菌株發(fā)酵液的pH值，繪制各發(fā)酵時(shí)間段所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液pH值的變化曲線，即為產(chǎn)酸速率曲線。

生長(zhǎng)曲線：按1.0×107CFU/mL的接種量將供試乳酸菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)。每隔2 h取1次液體發(fā)酵液樣品，保存于4 ℃冰箱中，最后以MRS培養(yǎng)基為空白，在620 nm下測(cè)定樣品的吸光值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制乳酸菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 乳酸菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定[13]：將篩選獲得的菌株分別涂布到MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落特征，取典型菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)，拍照。

生理生化鑒定[13]：包括石蕊牛奶、淀粉水解、精氨酸水解、精氨酸產(chǎn)氨、明膠液化、產(chǎn)H2S、馬尿酸鈉水解、葡聚糖產(chǎn)生、硝酸鹽還原、V-P試驗(yàn)、M-R試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性、pH 6.5、pH 4.5，以及菌株對(duì)阿拉伯糖、纖維二糖、衛(wèi)矛醇、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘油、肌醇、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、棉籽糖、鼠李糖、核糖、水楊苷、山梨醇、山梨糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、木糖、可溶性淀粉等22種碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)。

16S rDNA序列分析[14]：提取供試乳酸菌的DNA，利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定，將測(cè)得的16S rDNA序列結(jié)果按要求輸入GenBank中進(jìn)行序列檢索比對(duì)，獲得與已知序列微生物的相似性，從而確定供試乳酸菌的屬種信息。

1.2.3 乳酸菌生物學(xué)特性測(cè)定 溫度耐受性試驗(yàn)：將活化的乳酸菌按體積分?jǐn)?shù)6%接種量接入MRS液體培養(yǎng)基，分別置于10，15，18，37，45，50，60 ℃溫箱，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，恒溫培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定各組菌液的OD620 nm值。

耐酸堿試驗(yàn)：用無(wú)菌HCl和NaOH調(diào)MRS液體培養(yǎng)基pH至3.0，4.0，4.5，6.5，8.0，9.0，9.5，將活化的乳酸菌按體積分?jǐn)?shù)6%接種量接入不同pH值的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定各組菌液OD620 nm值。

耐鹽性試驗(yàn)：將活化的乳酸菌按6% 接種量接入含有質(zhì)量濃度為0，0.03，0.04，0.065，0.08，0.12，0.15 g/mL NaCl的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定各組菌液OD620 nm值。

產(chǎn)酸量測(cè)定：采用酸堿滴定法[15]，每隔2 h取乳酸菌的培養(yǎng)液，用0.1 mol/L NaOH 溶液滴定，推測(cè)產(chǎn)酸量。產(chǎn)酸量以吉爾涅爾度(°T)表示，即每100 mL培養(yǎng)液消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液記為1 °T。指示劑為質(zhì)量濃度10 g/L酚酞。

有機(jī)酸測(cè)定[16]：通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵液產(chǎn)酸組分分析，篩選出組分單一，乳酸含量高的菌株。將乳酸菌發(fā)酵液在3 000 r/min離心20 min，將上清液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后備用。利用waters的HPLC 2695測(cè)定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。流動(dòng)相為0.5%(NH4)2HPO4(用磷酸調(diào)pH為2.55)，流速2 mL/min；色譜柱C18，柱溫70 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)UV 214 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的特性

通過(guò)平板培養(yǎng)和鏡檢觀察，9株供試菌菌落皆為白色，圓形，菌體呈桿狀或球狀。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，接觸酶試驗(yàn)呈陰性，供試菌株特性詳見(jiàn)表1。

注：“G+”表示革蘭氏染色呈陽(yáng)性。

Note:“G+” denotes gram positive.

2.2 優(yōu)良乳酸菌篩選結(jié)果

2.2.1 葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn) 以R1、R7、R3、Rf、Re、Rg、Rn、Rb、Rd作為供試菌株，進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出，菌株R7、R3、Re、Rg產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，R1、Rf產(chǎn)酸能力次之；菌株R1、Rg產(chǎn)氣。因此，R7、R3、Re、Rf為同型發(fā)酵乳酸菌，R1、Rg為異性發(fā)酵乳酸菌。故篩選出6株產(chǎn)酸相對(duì)較強(qiáng)的乳酸菌(R7、R3、Re、Rg、R1、Rf)用于后續(xù)試驗(yàn)。

注：“-”表示不能夠產(chǎn)酸或產(chǎn)氣；“+” 、“++” 、“+++”表示產(chǎn)酸或產(chǎn)氣能力依次增強(qiáng)。

Note:“-”denotes no acid or gas;“+” ,“++” ,“+++”denotes the ability of acid or gas production enhanced gradually.

2.2.2 產(chǎn)酸速率及生長(zhǎng)曲線 將葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)中獲得的 6 株乳酸菌進(jìn)一步進(jìn)行生長(zhǎng)和產(chǎn)酸情況研究，其產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1和圖2。

產(chǎn)酸速率是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)，不同菌株之間差異較大。由圖1可以看出，6株菌的pH值變化趨勢(shì)一致，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，pH值逐漸下降。pH值在0～2 h變化不明顯，菌株處于適應(yīng)期，2 h以后pH值下降較快，說(shuō)明乳酸菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)代謝速度加快，20～36 h變化趨于平緩，表明菌株進(jìn)入穩(wěn)定期，代謝減慢。方差分析結(jié)果表明，不同乳酸菌菌株的pH值變化差異極顯著(F=17.42>F0.01=3.31)；不同培養(yǎng)時(shí)間pH值變化差異也極顯著(F=48.42>F0.01=2.42)。根據(jù)方差分析的結(jié)果對(duì)不同菌株、不同時(shí)間的pH值進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明R7、Rg、R3、Re這4株乳酸菌pH值下降較快，且這4株菌間差異不顯著。

由圖2可以看出，菌體在 6～18 h生長(zhǎng)最快，與圖1中pH值迅速下降的時(shí)間段相對(duì)應(yīng)，且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，可使菌株在較長(zhǎng)時(shí)間保持較高的活力，說(shuō)明菌株具有較強(qiáng)的繁殖力，在這個(gè)時(shí)期產(chǎn)酸量也最高。方差分析結(jié)果表明，不同乳酸菌菌株的OD值差異極顯著(F=18.20>F0.01=3.31)，不同培養(yǎng)時(shí)間OD值差異也極顯著(F=80.50>F0.01=2.42)。根據(jù)方差分析的結(jié)果對(duì)不同菌株、不同培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明，R7、Rg、R3、Re這4株乳酸菌生長(zhǎng)性能較好，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)，且菌株間差異不顯著。

綜合供試乳酸菌的產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)曲線結(jié)果可以看出,菌株R7、Rg、R3、Re生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酸能力均較好。

2.3 優(yōu)良乳酸菌鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 將篩選獲得的R7、Rg、R3和Re 4株優(yōu)良乳酸菌經(jīng)MRS平板培養(yǎng)，獲得的菌落皆為圓形、白色、奶油狀，邊緣整齊、黏稠、不易挑取。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，4株乳酸菌皆為桿狀，單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列，其菌落特征和菌體形態(tài)特征見(jiàn)圖3。

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果 對(duì)篩選獲得的4株乳酸菌R7、Re、Rg和R3進(jìn)行碳源利用方式及生理生化指標(biāo)鑒定，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。由表4可見(jiàn)，篩選獲得的 4 株乳酸菌無(wú)芽孢，革蘭氏陽(yáng)性，不能夠液化明膠，不水解淀粉，不還原硝酸鹽，不產(chǎn)生H2S，耐酸性能好，在pH 6.5時(shí)生長(zhǎng)良好，在pH 4.5時(shí)仍可生長(zhǎng)，且無(wú)運(yùn)動(dòng)性。結(jié)合表3乳酸菌對(duì)碳水化合物的利用方式，初步鑒定為乳桿菌屬的細(xì)菌。

2.3.3 16S rDNA鑒定結(jié)果 將供試乳酸菌測(cè)序結(jié)果輸入GenBank對(duì)比，結(jié)果表明，R7與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)具有100%的相似度，Rg與發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)具有98%的相似度，Re與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)具有100%的相似度，供試乳酸菌R3與戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)具有99%的相似度。

結(jié)合以上 4 株菌的鏡檢及菌落形態(tài)特征、生理生化和16S rDNA分析結(jié)果，確定R7為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，R3為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)，Rg為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，Re為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)。

注：“-”表示結(jié)果呈陰性；“+”表示結(jié)果呈陽(yáng)性；“++”表示結(jié)果呈較強(qiáng)陽(yáng)性；“+++”表示結(jié)果呈強(qiáng)陽(yáng)性。表4同。

Note:“-”denotes negative;“+”denotes positive;“++”denotes stronger positive;“+++”denotes the strongest positive.The same table 4.

2.4 乳酸菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 溫度耐受性、耐酸堿和耐鹽性 由圖4可以看出，各菌株OD值均比初始值要高，其生長(zhǎng)溫度為15～50 ℃，10 ℃和60 ℃時(shí)乳酸菌基本不生長(zhǎng)。37 ℃時(shí)OD值最大，為乳酸菌生長(zhǎng)最適溫度。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Rg相較其他菌株在50 ℃生長(zhǎng)良好，說(shuō)明Rg具有較強(qiáng)耐受高溫的能力，Re次之。由圖5可知，多數(shù)菌株在酸性條件下生長(zhǎng)較堿性條件好，但培養(yǎng)基pH值太高或太低均不利于乳酸菌生長(zhǎng)。各菌株在pH 6.5時(shí)OD值最大，說(shuō)明pH 6.5為各菌株的最佳培養(yǎng)條件。R7、Rg、R3、Re在pH 3.0，4.0和4.5時(shí)OD值均較初始值高，說(shuō)明4株菌均有較強(qiáng)的耐酸能力；Re在各種條件下均生長(zhǎng)較好，說(shuō)明Re具有較強(qiáng)的耐受酸堿的能力。由圖6可知，隨著NaCl質(zhì)量濃度增加各菌株生長(zhǎng)減弱。Rg和Re在0.08 g/mL NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較弱，R7和R3在含0.08 g/mL NaCl的培養(yǎng)基中較初始值顯著增高，除R7菌株外，其余菌株在含0.12 g/mL NaCl的培養(yǎng)基中基本不再生長(zhǎng)，說(shuō)明R7有較強(qiáng)的耐鹽能力。

2.4.2 產(chǎn)酸量 對(duì)4株乳酸菌不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)液進(jìn)行酸度測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖7。酸度從總體上反映了乳酸菌產(chǎn)酸能力的大小。由圖7可知，4 株乳酸菌酸度的變化趨勢(shì)一致。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，產(chǎn)酸總量呈上升趨勢(shì)，2～8 h產(chǎn)酸量迅速增加，產(chǎn)酸量高的時(shí)間段為 8～36 h，同時(shí)也是乳酸菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。酸度反映了菌株產(chǎn)酸總量的變化情況。從圖7可以看出，菌株R7、Rg、R3、Re產(chǎn)酸性能均較好，尤其是R7產(chǎn)酸量一直處于最高，24 h酸度達(dá)到146.4 °T。

2.4.3 有機(jī)酸組分 通過(guò)高效液相色譜對(duì)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸情況進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果待測(cè)菌株均在 2.438 min出峰，其相對(duì)含量結(jié)果見(jiàn)表5。由表5 可知，待測(cè)菌株經(jīng)液體發(fā)酵后均產(chǎn)生乳酸。R7、Rg、R3和Re 4株菌均無(wú)丁酸產(chǎn)生，丙酸相對(duì)含量較低。菌株R7乳酸相對(duì)含量最高，為95.40%；菌株R3乳酸相對(duì)含量也較高，為81.93%；菌株Rg乳酸相對(duì)含量為77.56%；菌株Re有乙酸產(chǎn)生，乳酸和丙酸相對(duì)含量之和所占比例較高，達(dá)到 86.44%。由此可以得出，菌株R7、Re、R3、Rg產(chǎn)酸相對(duì)單一且乳酸含量較高，與pH值及酸度測(cè)定結(jié)果一致。

3 討 論

青貯是一種很好的飼料利用方式，可通過(guò)乳酸菌的增殖，將原料中的可溶性糖轉(zhuǎn)化成乳酸等酸類物質(zhì)，創(chuàng)造酸性環(huán)境，抑制有害微生物的增殖，從而保存青貯飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分，達(dá)到飼料長(zhǎng)期貯存的目的[17]。然而，新鮮飼草表面只有極少量乳酸菌，但附著了大量的腐敗菌、丁酸菌、霉菌等有害菌。青貯開(kāi)始時(shí)依靠青貯料自身的少量乳酸菌短時(shí)間內(nèi)不能形成優(yōu)勢(shì)菌群，而腐敗菌大量繁殖占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，容易產(chǎn)生霉菌毒素和二次發(fā)酵。因此，簡(jiǎn)單的自然青貯不能滿足發(fā)酵的要求，分離篩選優(yōu)質(zhì)的乳酸菌就顯得非常重要。本研究結(jié)果表明，菌株R7、Rg、R3、Re具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、耐酸的特性，經(jīng)傳統(tǒng)鑒定方法及16S rDNA序列分析，R7為植物乳桿菌，R3為戊糖乳桿菌，Rg為發(fā)酵乳桿菌，Re為鼠李糖乳桿菌。這與張慧杰等[11]的研究結(jié)果適溫條件下乳酸桿菌的活力及生長(zhǎng)速度均優(yōu)于乳酸球菌相一致。

青貯要求在較短時(shí)間內(nèi)青貯基質(zhì)pH值迅速下降到4.0以下，這樣才能有效抑制真菌及其他雜菌的生長(zhǎng)。因此，產(chǎn)酸速率及快速生長(zhǎng)能力是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)。McDonald等[1]和Woolford[18]提出，用于青貯菌制劑的微生物應(yīng)具有均一發(fā)酵途徑，可快速發(fā)酵乳糖產(chǎn)生最大量的乳酸，能發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、果聚糖，尤其是戊糖，有耐酸能力，能快速降低pH值，至少使pH值最終達(dá)到4.0，以抑制其他微生物。本研究結(jié)果表明，菌株R7、Rg、R3、Re生長(zhǎng)及產(chǎn)酸能力俱佳，尤其是R7，在16 h可使發(fā)酵液pH值降至3.64，24 h酸度達(dá)到146.4 °T；其他菌株在發(fā)酵24 h后 pH值分別為3.61，3.65和3.67，且 4 株菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較長(zhǎng)。菌株R7、Rg、R3、Re在pH 3.0，4.0，4.5時(shí)均可旺盛生長(zhǎng)，說(shuō)明這 4 株菌都具有較強(qiáng)的耐酸能力，由于果渣本身pH值較低，因此篩選耐酸的菌株更有利于果渣青貯。

有機(jī)酸的含量及組成比例是確定青貯飼料發(fā)酵特性和評(píng)價(jià)青貯飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)。青貯飼料質(zhì)量的好壞取決于乳酸菌作用，乳酸是乳酸菌的主要產(chǎn)物，其含量是反映青貯飼料質(zhì)量最重要的指標(biāo)。乙酸的生成量與青貯飼料品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)[19]。丙酸可以抑制真菌繁殖，防止二次發(fā)酵。丁酸由酪酸菌產(chǎn)生，可直接反映青貯飼料的腐敗程度[20]。因此，選擇乳酸、乙酸、丙酸和丁酸作為主要分析對(duì)象。利用高效液相色譜對(duì)菌株R7、Rg、R3、Re的發(fā)酵液進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，菌株R7乳酸含量最高，相對(duì)含量為95.40%，菌株R3、Rg、Re發(fā)酵液乳酸相對(duì)含量分別為81.93%，77.56%，48.18%。菌株Re產(chǎn)生的丙酸可以有效抑制真菌繁殖。由此可以得出，菌株R7、Re、R3、Rg具有均一的發(fā)酵途徑，能發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，可作為制備青貯發(fā)酵劑的優(yōu)良菌株。近年來(lái)的研究表明，同型發(fā)酵乳酸菌與異型發(fā)酵乳酸菌混合使用更有利于養(yǎng)分保存和有氧條件下品質(zhì)穩(wěn)定，雖然異型發(fā)酵乳酸菌乳酸轉(zhuǎn)化效率較同型發(fā)酵乳酸菌的差，但異型發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生大量乙酸，乙酸具有抗真菌的作用，對(duì)防止有氧腐敗至關(guān)重要[21-23]。這些規(guī)律可為果渣青貯發(fā)酵菌劑的研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。菌株R7、Re、R3、Rg是否可以作為添加劑菌種還需要小規(guī)模發(fā)酵試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證,還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

1)本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的具有飼用價(jià)值的乳酸菌和青貯飼料中分離到的菌株為出發(fā)菌，通過(guò)葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣特征、產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)曲線等試驗(yàn)，篩選出4株生長(zhǎng)、產(chǎn)酸能力俱佳的菌株R7、R3、Re和Rg。

2)對(duì)篩選獲得的菌株經(jīng)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)及16S rDNA序列分析，確定R7為植物乳桿菌，R3為戊糖乳桿菌，Rg為發(fā)酵乳桿菌，Re為鼠李糖乳桿菌。

3)生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，R7、R3、Re和Rg 4 株菌均可在15～50 ℃較好生長(zhǎng)，且具有良好的耐酸耐堿性。R7和R3具有較強(qiáng)的耐鹽能力，Rg可耐受50 ℃高溫。菌株R7、Re、R3、Rg產(chǎn)酸單一且乳酸含量較高。這4株菌均有制備優(yōu)良果渣青貯發(fā)酵劑的潛能，可用于進(jìn)一步研究。

[1] McDonald P,Henderson A R,Heron S J E.The biochemistry of silage [M].Aberystwyth,UK:Chalcombe Publications,1991.

[2] 陶 蓮,玉 柱.華北駝絨藜青貯貯藏過(guò)程中發(fā)酵品質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化 [J].草業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(6):122-127.

Tao L,Yu Z.The dynamics ofCeratoidesarborescensfermentation quality in the process of ensiling [J].Acta Prataculturae Sinica,2009,18(6):122-127.(in Chinese)

[3] 李 靜,高蘭陽(yáng),沈益新.乳酸菌和纖維素酶對(duì)稻草青貯品質(zhì)的影響 [J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(4):86-90.

Li J,Gao L Y,Shen Y X.Effects of lactic acid bacteria and cellulase on the fermentation quality of rice straw silage [J].Journal of Nanjing Agricultural University,2008,31(4):86-90.(in Chinese)

[4] 申成利,陳明霞,李國(guó)棟,等.添加乳酸菌和菠蘿皮對(duì)柱花草青貯品質(zhì)的影響 [J].草業(yè)學(xué)報(bào),2012,21(4):192-197.

Shen C L,Chen M X,Li G D,et al.Effects of adding lactic acid bacteria and pineapple peel onStylosanthessilage quality [J].Acta Prataculturae Sinica,2012,21(4):192-197.(in Chinese)

[5] 張新平,萬(wàn)里強(qiáng),李向林,等.添加乳酸菌和纖維素酶對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)的影響 [J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2007,16(3):139-143.

Zhang X P,Wan L Q,Li X L,et al.The effect of adding lactic acid bacteria and cellulase onMedicagosativasilage quality [J].Acta Prataculturae Sinica,2007,16(3):139-143.(in Chinese)

[6] 興 麗,韓魯佳,劉 賢,等.乳酸菌和纖維素酶對(duì)全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物菌落的影響 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004(5):38-41.

Xing L,Han L J,Liu X,et al.Effects of lactobacillus and cellulase on the fermentation characteristics and microorganism of whole-plant corn silag [J].Journal of China Agricultural University,2004(5):38-41.(in Chinese)

[7] 蔡義民,熊井清雄,廖 芷,等.乳酸菌劑對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的改善效果 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),1995,28(2):73-82．

Cai Y M,Xiong J Q X,Liao Z,et al.Effect of lactic acid bacteria inoculants on fermentative quality of silage [J].Scientia Agricultura Sinical,1995,28(2):73-82.(in Chinese)

[8] 何軼群,雷趙民,吳 潤(rùn),等.青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究 [J].生物技術(shù)通報(bào),2013(5):177-183.

He Y Q,Lei Z M,Wu R,et al.Isolation and identification of excellent lactic acid bacteria from silage and its biological characteristics research [J].Biotechnology Bulletin,2013(5):177-183.(in Chinese)

[9] 段宇珩,談重芳,王雁萍,等.青貯飼料中微生物及乳酸菌特性初步研究 [J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(6):111-124.

Duan Y H,Tan Z F,Wang Y P,et al.The characteristics of microorganisms and lactic acid bacteria in silage [J].Journal of Henan Agriculture Sciences,2008(6):111-124.(in Chinese)

[10] 劉 飛,楊麗杰,侯俊財(cái),等.青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定 [J].江西飼料,2007(1):22-25.

Liu F,Yang L J,Hou J C,et al.Isolation and identification of excellent lactic acid bacteria from silage [J].Jiangxi Feed,2007(1):22-25.(in Chinese)

[11] 張慧杰,玉 柱,王 林,等.青貯飼料中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選 [J].草地學(xué)報(bào),2011,19(1):137-141.

Zhang H J,Yu Z,Wang L,et al.Isolation and identification of lactic acid bacteria from silage and filtering of excellent strains [J].Acta Agrestia Sinica,2011,19(1):137-141.(in Chinese)

[12] 凌代文,東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法 [M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1999.

Ling D W,Dong X Z.The classification and identification of lactic acid bacteria and its experimental method [M].Beijing: China Light Industry Press,1999.(in Chinese)

[13] 程麗娟,薛泉宏,來(lái)航線,等.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) [M].西安：世界圖書出版公司,2000.

Cheng L J,Xue Q H,Lai H X,et al.The experimental method of microbiology [M].Beijing:World Publishing Corporation,2000.(in Chinese)

[14] 李 麗.鹽堿環(huán)境中放線菌多相分類及免培養(yǎng)研究 [D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2006.

Li L.Studies on polyphasic taxonomy and culture independent method of actinomycetes in saline environments [D].Yang-ling,Shaanxi:Northwest A&F University,2006.(in Chinese)

[15] 史媛英,肖冬光.酸奶發(fā)酵劑高濃度培養(yǎng)的研究 [J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),1999(1):20-25.

Shi Y Y,Xiao D G.The study on the culture with high cells population on yoghurt starter [J].Journal of Tianjin Institute of Light Industry,1999(1):20-25.(in Chinese)

[16] 許慶方,玉 柱,韓建國(guó).高效液相色譜法測(cè)定紫花苜蓿青貯中的有機(jī)酸 [J].草原與草坪,2007(2):63-67.

Xu Q F,Yu Z,Han J G.Determining organic acid in alfalfa silage by HPLC [J].Grassland and Turf,2007(2):63-67.(in Chinese)

[17] 張子儀.中國(guó)飼料學(xué) [M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000:334.

Zhang Z Y.Chinese feed [M].Beijing:China Agriculture Press,2000:334.(in Chinese)

[18] Woolford M K.The detrimental effects of air on silage [J].Journal of Applied Bacteriology,1990,68:101-112.

[19] 林秋萍,李 瑾,馮書惠,等.揮發(fā)性脂肪酸和乳酸的測(cè)定方法研究 [J].飼料工業(yè),2006,27(15):32-33.

Lin Q P,Li J,Feng S H,et al.Study of the measuring methods of volatile fatty acids and lactic acid [J].Feed Industry,2006,27(15):32-33.(in Chinese)

[20] 劉桂要.玉米秸桿青貯過(guò)程中微生物、營(yíng)養(yǎng)成分及有機(jī)酸變化規(guī)律的研究 [D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2009．

Liu G Y.Studies on the changes of microorganism,nutrients and organic acid during ensiling for corn straw [D].Yangling,Shaanxi:Northwest A&F University,2009．(in Chinese)

[21] Filya I.The effect ofLactobacillusbuchneri,with or without homofermentative lactic acid bacteria,on the fermentation,aerobic stability,and ruminal degradability of wheat,sorghum,and maize silages [J].Appl Microbiol,2003(95):1080-1086.

[22] Kung J,Schmidt R J.The effect ofLactobacillusbuchneri40788 on the fermentation and aerobic stability of ground and whole high-moisture corn [J].Dairy Sci,2007(90):2309-2314.

[23] Danner H,Holzer M,Mayrhuber E,et al.Acetic acid increases stability of silage under aerobic conditions [J].Appl Environ Microbiol,2003(69):562-567.

Screening of lactic acid bacteria strains and their biological characteristics

HOU Xia-xia,LAI Hang-xian,WEI Xiao-min

(CollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to screen acid bacteria strains for pomace silage additive usage which grow fast and have strong acid production capacity and acid tolerance.【Method】 The tested strains were screened based on acid and gas production characteristics,acid production rate,and growth curve in glucose fermentation.The selected strains were identified through morphological observation,physiological and biochemical tests,and 16S rDNA sequence analysis.We further studied the growth temperature range,acid and alkali resistance,salt resistance,acidity,and organic acids components of selected strains.【Result】 Four lactic acid bacteria strains,R7,R3,Rg,and Re,were screened.Through morphological observation,physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis,R7 wasLactobacillusplantarum,R3 wasLactobacilluspentosus,Rg wasLactobacillusfermentum,and Re wasLactobacillusrhamnosus.All the strains can grow at temperatures between 15 to 50 ℃.Strain R7 grew fastest and had the strongest acid produce capacity.Its lactic acid content was also the highest,accounting for 95.40% of the total acid content.It grew well with pH of 3.0 and can tolerate NaCl with mass concentration of 0.08 g/mL.The growth and acid productions of Re and R3 were less than that of R7,and they also had strong acid and alkali resistance.Rg grew well at temperature of 50 ℃,showing strong high temperature tolerance.【Conclusion】 Strains R7,Re,R3 and Rg showed good biological characteristics including fast growth,strong acid production capacity and acid tolerance,and high lactic acid content,and they can be applied to the preparation of pomace silage additives.

silage fermentation agent;lactic acid bacteria;acid-production performance

2013-09-13

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD14B11)；國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“果渣飼料化生產(chǎn)技術(shù)集成及產(chǎn)業(yè)化”(K303021204)

侯霞霞(1989-),女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，在讀碩士，主要從事微生物資源與利用研究。E-mail:houxia1989@126.com

來(lái)航線(1964-)，男，陜西禮泉人，副教授，博士，主要從事微生物生態(tài)和微生物資源與利用研究。 E-mail:laihangxian@163.com

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.019

S816.6；TQ920.1

A

1671-9387(2015)01-0183-10

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.019.html