馬艷芝，客紹英

(唐山師范學院 生命科學系，河北 唐山 063000)

不同柴胡種質資源的ISSR和ITS序列分析

馬艷芝，客紹英

(唐山師范學院 生命科學系，河北 唐山 063000)

【目的】 利用ISSR標記和ITS序列分析方法，對11份柴胡種質進行鑒定和親緣關系分析，為柴胡種質資源利用和進化分析提供理論依據。【方法】 以取自不同省份的11份柴胡干品為材料，提取其基因組DNA，進行ISSR分析，利用DPS(V7.5)軟件計算遺傳距離，利用UPGMA方法進行聚類分析，構建11份柴胡樣品的系統(tǒng)進化樹。同時，利用ITS引物對柴胡樣品進行PCR擴增和測序，利用DNAMAN軟件分析11份柴胡種質的ITS序列，對其遺傳相似性進行鑒定?！窘Y果】 從100條ISSR引物中篩選出21條擴增譜帶清晰、多態(tài)性高的引物，利用這21條引物從11份柴胡樣品中共獲得185條擴增條帶，其中156條條帶呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性條帶比例為84.3%。11份柴胡樣品間遺傳距離為0.458 8～0.782 2，表明這11份柴胡樣品間遺傳基礎較狹窄；聚類結果將11份柴胡樣品分成2大類，大部分來源相同或相近的柴胡樣品聚在一起。ITS序列分析結果表明， 11份柴胡樣品的ITS序列均長321 bp,也可以分為2類，部分柴胡樣品存在同質異名現(xiàn)象?！窘Y論】 利用ITS技術或將其與ISSR標記相結合對柴胡種質資源進行鑒定和分析，可以提高柴胡種質資源鑒定的準確性和效率。

柴胡；ISSR；ITS；種質資源；遺傳多樣性；聚類分析

柴胡(Radix Bupleuri)已有2000年以上的藥用歷史，是最常用的藥用植物之一，可用于治療發(fā)熱、流感、胸部擴張性疼痛、月經紊亂等癥[1-2]，具有抗病毒感染、抗?jié)儭⒖鼓[瘤、免疫調節(jié)和保肝等多種功效[3-7]。柴胡為傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(BupleurumL．)植物，柴胡屬內植物種類很多，全世界有200種左右[8]，是傘形科的一個大屬。據記載，我國共有柴胡屬植物41種、17個變種及7個變型[9]。包括柴胡屬在內的傘形科植物的分類、鑒定一直是植物研究的熱點之一。由于柴胡分布范圍較廣(遍及我國東北、華北、西北、華東和華中)，加之對其種質多樣性的復雜程度認識不足，對種質的描述界定也相對寬泛，因此柴胡種下的準確分類、鑒定是一個比較困難的問題。分子生物學技術的發(fā)展為植物分類與鑒定提供了更多手段。目前，已有利用脂酶同工酶譜帶[10]、RAPD方法[11]及ITS序列分析[12-13]對柴胡屬不同種進行鑒定的研究報道。對于柴胡而言，其野生資源日漸減少，栽培品種選育也迫在眉睫，因此借助分子標記手段篩選柴胡育種材料，對其雜種后代進行早期選擇鑒定[14]，可以減少育種的盲目性，加速育種進程。

簡單序列重復區(qū)間擴增(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)標記是由加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz等在1994年提出的，該標記具有模板需求量少、多態(tài)性豐富、操作簡單、穩(wěn)定性高等優(yōu)點[15]，現(xiàn)已被廣泛用于植物群體遺傳多樣性分析和種質鑒定等研究[16-17]。利用ISSR標記可以對柴胡種質進行鑒定，明確其遺傳差異和親緣關系。高等植物中的rRNA基因(rDNA)是高度重復的串聯(lián)序列單位，由18S rDNA、26S rDNA、5.8S rDNA和位于三者之間的基因內轉錄間隔區(qū)ITS序列(Internal Transcribed Spacer)組成，聯(lián)結在一起為一個轉錄單位，其中ITS區(qū)由5.8S rDNA所分隔的ITS1和ITS2 2個片段組成。ITS序列變異較快，高度重復，且可以通過不等交換和基因轉換達到同步進化，可以提供豐富的變異位點和信息點，所以被廣泛用于植物系統(tǒng)進化和種質鑒定研究[18]。本研究通過ISSR標記和ITS序列分析，對11份柴胡種質進行鑒定，分析其親緣關系，以期為柴胡種質資源利用和進化分析提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試柴胡材料共11份，取自山西、河北等省(表1)，材料名稱為當?shù)亓暦Q。

1.2 試劑及儀器

提取DNA的試劑均為分析純，購自上海生工生物工程有限公司；ISSR PCR擴增所用試劑均購自大連寶生物公司；ITS PCR擴增所用2×PCR Mix 購自北京匯天東方科技有限公司；ITS PCR 產物回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。ISSR PCR 擴增在Biometra公司的梯度PCR儀上進行，ITS PCR 擴增在BioRad公司MyCycler PCR儀上進行。

1.3 柴胡DNA的提取

柴胡DNA的提取參照SDS法[11]，并有所改進。取柴胡干品，用旋風磨粉碎，取0.4 g柴胡粉末至2.0 mL離心管中，加入65 ℃預熱的SDS提取液900 μL，充分混勻后于65 ℃水浴30 min。加入等體積的苯酚/氯仿(V(苯酚)∶V(氯仿)=1∶1)混勻，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液；再加入等體積的氯仿/異戊醇(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，混勻，12 000 r/min離心10 min；吸取上清液，加入2倍體積的-20 ℃無水乙醇沉淀DNA，用體積分數(shù)70%的乙醇洗滌DNA 2次，室溫下晾干至透明，加200 μL TE使DNA完全溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用分光光度計測OD260和OD280，通過OD260/OD280值及1%瓊脂糖凝膠電泳評估DNA質量。

1.4 ISSR擴增檢測

100條ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的ISSR引物序列設計，由上海生工生物工程有限公司合成。反應體系為：10× PCR buffer 2.5 μL，模板DNA 20 ng，引物2 μL(0.1～0.5 μmol/L)，MgCl21.5 μL，dNTP 2 μL，TaqDNA聚合酶2 U，加ddH2O至25 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，退火(47～54 ℃)1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，5 V/cm電壓條件下電泳45 min，EB(溴化乙錠)染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結果，同一引物、同一位點有擴增條帶的記為“1”，無擴增條帶的則記為“0”。利用統(tǒng)計分析軟件DPS(V7.5)計算遺傳距離，采用UPGMA方法進行聚類分析。

1.5 ITS的PCR擴增及檢測

1.5.1 ITS的PCR擴增 ITS引物參考武瑩等[19]報道的序列設計，ITS-F：GGAAGTAAAAGTCG-TAACAAGG，ITS-R：GCTGCGTTCTTCANTCG-ATGC，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系總體積為50 μL，其中2×PCR Mix 25 μL，模板DNA 80 ng，上、下游引物(20 mmol/L)各1 μL，用ddH2O補充反應體系至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，10 ℃保溫。

1.5.2 擴增產物的檢測 為了提高分辨率，ITS PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。電泳采用北京六一廠DYY-7C型電泳儀和DYC-34A型電泳槽進行，1×TAE電泳緩沖液，210 V電泳45 min。電泳完畢后用EB浸泡染色約10 min，凝膠成像系統(tǒng)下照相，記錄電泳結果。

目標條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收。T-載體采用pMD20-T載體，連接體系為：pMD20-T載體1 μL，回收產物2.5 μL，ddH2O 1.5 μL，Solution Ⅰ 5 μL，16 ℃連接30 min。連接后的載體利用熱激法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，轉化后的大腸桿菌DH5α涂布在含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB培養(yǎng)基(酵母提取物5 g，胰蛋白凍10 g，NaCl 10 g，瓊脂粉6 g，加蒸餾水至1 L)上，并進行藍白斑篩選。每個LB平板挑取3個陽性克隆進行測序，序列測定由深圳華大科技公司完成，序列分析采用DNAMAN軟件進行。

2 結果與分析

2.1 ISSR引物對11份柴胡的擴增結果

對100條ISSR引物進行篩選，從中篩選出21條擴增條帶清晰、多態(tài)性好且重復性好的引物，其中多態(tài)性比率較高的引物有UBC810、UBC811、UBC814、UBC845、UBC859和UBC892(表2)。用這21條引物對11份供試柴胡材料進行擴增，共獲得185條擴增條帶，平均每條引物獲得7.4條條帶；在185條條帶中，有156條條帶為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比例為84.3%(表2)，表明這21條ISSR引物可以用于柴胡種質資源遺傳多樣性的檢測。

2.2 基于ISSR引物對11份柴胡的聚類分析

利用統(tǒng)計分析軟件DPS(V7.5)計算遺傳距離，結果(表3)顯示，11份柴胡樣品間的遺傳距離比較小，在0.458 8～0.782 2，表明這些柴胡樣品之間的親緣關系差別不大。其中，10號與11號柴胡材料親緣關系最近，遺傳距離為0.458 8；其次為8號與9號柴胡材料，遺傳距離為0.478 3；2號與10號柴胡材料的親緣關系最遠，遺傳距離為0.782 2。采用UPGMA方法對ISSR引物的擴增結果進行聚類分析，結果見圖1。從圖1可以看出，11份柴胡材料都聚在遺傳距離為0.46～0.71的類群中。在遺傳距離0.7處可將供試的11份柴胡樣品分成2大類，第1大類包括1、2、4、5、7、10和11號共7份材料，其中10號與11號材料親緣關系較近，4號與5號材料親緣關系較近；第2大類包括3、6、8和9號共4份材料，其中8號與9號材料親緣關系較近，3號與6號材料親緣關系較近。

注：表中各編號所示樣品與表1同。

Note:The numbers of the materials in the table1 were the same as table 1.

2.3 利用ITS引物對11份柴胡的PCR擴增結果

利用ITS引物對11份柴胡樣品進行PCR擴增，得到2條清晰的條帶，其中一條帶長244 bp，另一條帶長321 bp(圖2)。將2條帶進行切膠回收、測序，然后將測序結果在NCBI數(shù)據庫中進行Blast檢索比對，結果顯示，長244 bp條帶序列與真菌18S和5.8S核糖體RNA基因序列的相似性達99%，而長321 bp的條帶序列與柴胡18S和5.8S核糖體RNA基因序列的相似性達98%，說明321 bp條帶為柴胡樣品的ITS擴增條帶，而244 bp的條帶則可能是柴胡干品中存在真菌污染等原因造成的。

利用DNAMAN軟件對11份柴胡樣品的ITS序列進行分析，結果(圖3)顯示,這11份樣品的ITS序列均為321 bp，且序列相似性非常高，達97.5%，不同材料間ITS序列不存在插入/缺失，但包含一些單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點。依據ITS序列，11份柴胡樣品同樣被分為2大類，第1大類包括1、2、4、5、7、10和11號共7份材料，其中除1號樣品第199位點處為T堿基外，這7份材料的ITS序列完全相同(由于ITS-R引物包含1個兼并位點，所以ITS序列第309位點的差異不計算在內)；3、6、8和9號4份材料的ITS序列存在5處SNP位點94(A)、125(T)、157(T)、172(G)和228(T)，這5個SNP位點構成單倍型(Haplotype)，將這4份材料歸入第2類(圖3)。

3 討 論

3.1 不同柴胡樣品的同一性鑒定

在本研究中，11份柴胡樣品包括北柴胡、黑柴胡、31號柴胡和紅柴胡等多種材料，分別來源于7個省的10個不同地區(qū)，但ISSR結果顯示，這11份材料分為2大類，其中1號(黑柴胡，山西萬榮)、2號(北柴胡，河北張家口)、4號(黑柴胡，甘肅隴西)、5號(北柴胡，河南盧氏)、7號(805柴胡，山東樂陵)、10號(黑柴胡，湖南邵東)和11號(紅柴胡，甘肅臨洮)聚為一類。ITS序列分析結果也顯示，這7份材料雖然產地不同，材料名稱也不相同，但除1號樣品有1處SNP位點外，7份材料的ITS序列完全一致，表明這7份柴胡樣品或者親緣關系非常近，或者存在同質異名現(xiàn)象。

同質異名現(xiàn)象在柴胡生產中普遍存在，這是由于柴胡自然分布廣泛，且不同地區(qū)之間相互引種，致使種質親緣關系不清；同時由于各地柴胡習稱及民間用藥歷史和習慣不同，也導致柴胡在使用和栽培中產生種質混亂的現(xiàn)象。《中國藥典》中載入的柴胡只有傘形科植物柴胡(B.chineseDC.)和狹葉柴胡(B.scorzonerifoliumWilld)，前者習稱“北柴胡”、“硬柴胡”等，后者習稱“南柴胡”、“軟柴胡”或“紅柴胡”等，但生產中如錐葉柴胡(B.bicaule)、銀州柴胡(B.yinchowense)、黑柴胡(B.smithii)和柴首(B.chaishoui)等20多種植物在不同地區(qū)也被當作柴胡藥用。北柴胡主要分布于河北、河南、山東、吉林、遼寧、甘肅、陜西等省，黑柴胡主要產自內蒙古、甘肅、寧夏、青海等省，在地理分布上黑柴胡與北柴胡較接近，在生產中容易混淆。由于紅柴胡與北柴胡均是《中國藥典》記載的正品柴胡藥材，所以在藥品生產中常被混用而不加區(qū)別，這也造成紅柴胡和北柴胡容易相互混淆。從遺傳學角度講，北柴胡、紅柴胡與黑柴胡間的親緣關系也非常接近。宋蕓等[20]對6種柴胡屬植物的核型分析結果顯示,北柴胡、紅柴胡與黑柴胡間的親緣關系較近，其染色體數(shù)均為2n=12，且紅柴胡與北柴胡核型近似系數(shù)達到0.992，核型進化距離最小(0.008)，表明北柴胡與紅柴胡的親緣關系非常近，這與本試驗結果相同。

三島柴胡(B.falcatum)也叫“31號柴胡”、“川島柴胡”和“黃柴胡”等，原產于日本及朝鮮等地，于20世紀80年代引入我國，現(xiàn)在甘肅、陜西等地有較大規(guī)模種植，其主要成分及藥理與國產柴胡基本相同。因其形狀與其他柴胡特別是北柴胡較相似，故容易引起混淆，但三島柴胡體細胞染色體數(shù)為2n=26，從核型分析結果看，三島柴胡與黑柴胡核型近似系數(shù)較小(0.479 4)，核型進化距離較大(0.735 2)，故三島柴胡與黑柴胡的親緣關系較遠[20]。本試驗中3號(31號柴胡)、6號(黃柴胡)、8號(三島柴胡)和9號(31號柴胡)柴胡樣品同屬三島柴胡，只是習稱不同而已， ISSR試驗結果中這4份材料聚在同一類，且這4份柴胡樣品的ITS序列相同，與北柴胡的ITS序列存在較大差異。

3.2 分子檢測在柴胡種質資源鑒定中的有效性

由于柴胡屬植物種類多，分布廣泛，表型特征相似度高，因此存疑類群較多，屬下種間分類不清，給柴胡屬植物資源鑒定和利用造成了較大困難[21]。雖然前人已從形態(tài)學[22-23]、植物化學[24-25]等方面開展了很多工作，認為葉片、果實形態(tài)和解剖學特征以及類群間某些化學成分的差異可作為區(qū)分不同柴胡種質資源的依據，但由于柴胡從野生種到栽培種的變化過程中，通常是農戶自種自繁，沒有明確的種子、種苗來源，不同地區(qū)的種質也是隨意引種種植，留種過程缺乏去雜除劣措施，這就造成不同種質相互混雜。另外，由于柴胡為異花授粉植物，柴胡種質常常是遺傳背景混雜的群體，不同個體間形態(tài)也常表現(xiàn)出一定的差異[26]。邵天玉等[27]發(fā)現(xiàn)，按照植物志的描述，不同種質來源的柴胡樣品確實都只能歸屬于北柴胡(B.chinense)這一大類群，然而它們在生物學特性等方面卻存在很大差異。所以，僅使用形態(tài)學等方法區(qū)分不同柴胡種質是不準確的。因此柴胡種質資源的鑒定對柴胡種質的利用、育種和生產，以及充分利用活性成分不同的各種質柴胡進行藥劑生產具有重要意義。

張永剛等[28]認為，有些柴胡屬種質雖然在生物學分類上屬于同一類，但它們在分子水平上仍存在較大差異，這是遺傳與環(huán)境交互作用的結果。因此，利用分子檢測手段可以更有效地區(qū)分種間差異，為柴胡種質鑒定、篩選、培育和野生資源保護利用提供可靠的依據。ISSR是一種操作簡單、穩(wěn)定性高的分子標記技術，可以很好地揭示柴胡種質資源的多態(tài)性。隋春等[14]建立了適于柴胡的ISSR分析體系，并采用ISSR技術分析了3份柴胡栽培種質個體間及種間的差異。白楊[29]以三島柴胡和銀川柴胡為對照，采用ISSR技術標記不同產地柴胡的DNA，分析了不同產地、不同品種柴胡的遺傳多樣性、親緣關系及其與藥材品質的相關性。武瑩等[19]通過對北柴胡、狹葉柴胡、竹葉柴胡、黑柴胡以及柴胡近緣屬植物孜然芹的序列ITS分析表明，ITS1和ITS2序列信息位點豐富，不同種類的柴胡均可檢測到特異性的變異位點。同時，還有學者利用ITS序列分析技術，對來源于歐洲西南部和非洲西北部的32個柴胡種質進行了系統(tǒng)研究[13]。由于ITS技術是直接對柴胡樣品的rDNA序列進行測定，其檢測準確性比ISSR標記有了更進一步的提高，所以利用ITS技術或者將其與ISSR標記相結合進行柴胡種質資源的鑒定工作，可有效地提高柴胡種質鑒定的準確性和效率。

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ISSR-PCR and ITS sequence analysis ofBupleurumgermplasm resources

MA Yan-zhi,KE Shao-ying

(DepartmentofLifeSciences,TangshanTeacher’sCollege,Tangshan,Hebei063000,China)

【Objective】 This paper aimed to identify and analyze germplasm resources of 11Bupleurumvarieties using ISSR-PCR and ITS sequence analysis methods,which would provide a theoretical basis for resource utilization and evolution analysis ofBupleurumgermplasm.【Method】 DNA samples were extracted from 11 dryBupleurumcultivars.With ISSR-PCR,genetic similarity coefficients (GS) were calculated by DPS software and cluster analysis was conducted by UPGMA.The ITS sequences of 11Bupleurumcultivars were obtained after PCR and sequencing and the DNAMAN software was employed to align the ITS sequences.The genetic similarity was also identified.【Result】 21 out of 100 primers with clear amplification spectrum and high polymorphism were selected,and a total of 185 fragments were amplified,among which 156 fragments were polymorphic with a ratio of 84.3%.The GS varied from 0.458 8 to 0.782 2,indicating that the genetic diversity of these cultivars was relatively low.Both UPGMA cluster and ITS sequence analysis showed that the tested 11Bupleurumcultivars could be divided into two categories.The average sequence length of the samples was 321 bp.Some cultivars were homogeneous.【Conclusion】 Using ITS and ISSR methods increased the accuracy and efficiency ofBupleurumgermplasm resources analysis.

BupleurumL.;ISSR;ITS;germplasm resources;genetic diversity;cluster analysis

2014-06-11

國家科技部子課題項目(2011BAI07B05-4)；河北省科技廳項目(10965511D)；唐山市科技重大項目(12130203A)；唐山師范學院博士基金項目(11A01)

馬艷芝(1977-)，女，河北唐山人，副教授，碩士，主要從事藥用植物與生物技術研究。E-mail：mayanzhiwxd@163.com

時間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.020

S567.7+9

A

1671-9387(2015)01-0193-08

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.020.html