白亞玲，徐金升，靳晶晶，張俊霞，張勝雷，崔立文，張慧然

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·論著·

鎂離子對大鼠血管平滑肌細胞鈣化相關(guān)因子表達的影響

白亞玲，徐金升，靳晶晶，張俊霞，張勝雷，崔立文，張慧然

目的 探討鎂離子對大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)鈣化相關(guān)因子表達水平的影響。方法 選擇5周齡健康雄性SD大鼠6只。以組織貼壁法進行原代VSMCs培養(yǎng)，至3～5代時用于細胞實驗。將VSMCs采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、高磷組(加入10 mmol/L β-甘油磷酸)、鎂干預組〔加入10 mmol/L β-甘油磷酸+3 mmol/L硫酸鎂(MgSO4)〕、2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-APB)干預組(10 mmol/L β-甘油磷酸+3 mmol/L MgSO4+10-4μmol/L 2-APB)。采用鄰甲酚酞絡合酮比色法檢測細胞培養(yǎng)14 d后鈣化情況，酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞培養(yǎng)14 d后堿性磷酸酶(ALP)活性，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測0、3、6、10、14 d時細胞內(nèi)基質(zhì)G蛋白(MGP)mRNA和骨橋蛋白(OPN)mRNA的表達水平。結(jié)果 細胞培養(yǎng)14 d后，4組鈣水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=409.800，P<0.05)；高磷組、2-APB干預組鈣水平高于正常對照組和鎂干預組 (P<0.05)。4組ALP活性比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=490.901，P<0.05)；高磷組、2-APB干預組ALP活性高于正常對照組和鎂干預組 (P<0.05)。培養(yǎng)14 d后，4組MGP mRNA和OPN mRNA的表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=1 279.905、1 157.247，P<0.05)；鎂干預組MGP mRNA和OPN mRNA的表達水平高于高磷組及2-APB干預組 (P<0.05)。動態(tài)觀察MGP mRNA和OPN mRNA的表達變化，結(jié)果顯示在培養(yǎng)第3天時，高磷組MGP mRNA和OPN mRNA表達水平均降低(P<0.05)，并隨著時間的延長呈下降趨勢；鎂干預組MGP mRNA和OPN mRNA表達水平均升高(P<0.05)，并隨著時間的延長呈上升趨勢。結(jié)論 高濃度鎂離子在抑制VSMCs鈣化過程中可上調(diào)MGP及OPN的表達，并呈一定時間依賴性，為臨床進一步研究提供了參考依據(jù)。

肌細胞,平滑肌；β-甘油磷酸鹽；鎂離子；血管鈣化；基質(zhì)G蛋白；骨橋蛋白質(zhì)

白亞玲，徐金升，靳晶晶，等.鎂離子對大鼠血管平滑肌細胞鈣化相關(guān)因子表達的影響[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(6)：665-668.[www.chinagp.net]

Bai YL,Xu JS,Jin JJ,et al.Effect of magnesium on factors related to calcification in rat vascular smooth muscle cells[J].Chinese General Practice，2015，18(6)：665-668.

血管鈣化是慢性腎衰竭患者體內(nèi)常見的病理現(xiàn)象，已成為增加心血管疾病發(fā)病率及病死率的重要原因之一[1]。鎂離子是體內(nèi)重要的陽離子，對維持血管彈性有重要作用[2]，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)鎂離子可在一定程度上抑制高磷誘導的血管平滑肌細胞(VSMCs)鈣化和成骨樣轉(zhuǎn)分化，其可能是通過抑制VSMCs中骨源性相關(guān)因子的表達來實現(xiàn)[3]。而研究表明，血管鈣化形成過程中除鈣化相關(guān)促進因子(如骨源性相關(guān)因子)表達水平增加外，還伴有相關(guān)抑制因子表達水平降低[4]。因此，本研究以VSMCs鈣化為模型，研究鎂離子對VSMCs鈣化相關(guān)的抑制因子—基質(zhì)G蛋白(MGP)和骨橋蛋白(OPN)表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選擇5周齡健康雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量80～100 g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Hyclone公司,DMEM培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle′s medium)購自美國GIBCO公司，兔抗鼠平滑肌肌動蛋白單克隆抗體購自北京博奧森生物有限公司，免疫組化試劑盒購自上海博海生物有限公司，β-甘油磷酸及2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯(2-APB)購自美國Sigma 公司，堿性磷酸酶(ALP)活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自美國Fermentas公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，鈣測定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，細胞培養(yǎng)箱購自美國Sheldon公司,RT-PCR儀購自美國Abi公司。

1.3 方法

1.3.1 原代VSMCs培養(yǎng)及鑒定 以組織貼壁法進行原代VSMCs培養(yǎng)。原代VSMCs形態(tài)學觀察：應用倒置相差顯微鏡觀察細胞大小、形態(tài)、生長特點及排列方式等。免疫組化法染色：6孔板內(nèi)用消毒的蓋玻片制作細胞爬片，待細胞貼壁生長至60%～70%時，棄去培養(yǎng)基，用免疫組化法鑒定VSMCs特異性抗體A-SMA actin，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復染，經(jīng)分化、脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察，胞質(zhì)內(nèi)表達為強陽性，并可見棕黃色的免疫產(chǎn)物可判定為陽性結(jié)果,當細胞隨傳代而自行純化時，細胞理化性質(zhì)無明顯改變。原代VSMCs傳代培養(yǎng)至3～5代時用于細胞實驗。

1.3.2 實驗分組及造模 將VSMCs采用隨機數(shù)字表法隨機分為4組：(1)正常對照組：加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)；(2)高磷組：在正常對照組培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10 mmol/L β-甘油磷酸誘導鈣化；(3)鎂干預組：高磷組培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入3 mmol/L硫酸鎂(MgSO4)溶液；(4)2-APB干預組：在鎂干預組培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10-4μmol/L 2-APB。

1.3.3 VSMCs鈣化及ALP活性測定 采用鄰甲酚酞絡合酮比色法檢測細胞鈣化情況：細胞培養(yǎng)14 d后棄去上清液，加入0.6 mol/L鹽酸溶液37 ℃脫鈣過夜，取上清液測鈣水平，再用0.1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)和0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液溶解細胞30 min，BCA法測定細胞蛋白水平，結(jié)果用細胞鈣水平比蛋白水平表示(mg/g蛋白)。酶聯(lián)免疫吸附法檢測ALP活性：細胞培養(yǎng)14 d后棄去上清液，依據(jù)ALP活性試劑盒測定其活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。上述實驗均重復3次，結(jié)果為3次平均值。

1.3.4 RT-PCR法檢測VSMCs MGP mRNA和OPN mRNA的表達 分別提取0、3、6、10、14 d時正常對照組、高磷組、鎂干預組以及14 d時2-APB干預組細胞的總mRNA，測定MGP和OPN的表達。PCR引物由Primer 5.0軟件設(shè)計，MGP上游引物為：5′-AAAGCCCAGGAAAGAGTCCG-3′，下游引物為：5′-TCTTATTTGGCTCCTCGGCG-3′；OPN上游引物為：5′-ATGCTATCGACAGTCAGGCG-3′，下游引物為：5′-GCTCAGGGCCCAAAACACTA-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酸(GAPDH)上游引物為：5′-CCCACTAAAGGGCATCCTGG-3′，下游引物為：5′-GGCCCCTCCTGTTGTTATGG-3′。PCR反應體系為20 μl。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，MGP 55 ℃、OPN 56 ℃ 、GAPDH 57 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s(共35個循環(huán))；最后72 ℃延伸10 min。實驗均重復3次，結(jié)果為3次平均值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠VSMCs原代培養(yǎng)及鑒定 大鼠胸主動脈組織塊貼壁3～4 d后可見細胞從組織塊邊緣爬出，細胞為長梭形，呈束狀排列，6～7 d后融合成片，細胞呈星形或不規(guī)則形，以梭形為主，相互重疊生長。細胞質(zhì)A-SMA actin表達強陽性，呈棕黃色(見圖1)。

圖1 大鼠VSMCs細胞質(zhì)A-SMA actin表達情況(免疫組化染色法，×200)

Figure 1 The rat VSMCs cytoplasmic expression of A-SMA actin

2.2 4組鈣水平及ALP活性比較 細胞培養(yǎng)14 d后，4組鈣水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=409.800，P<0.05)；高磷組、2-APB干預組鈣水平高于正常對照組和鎂干預組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4組ALP活性比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=490.901，P<0.05)；高磷組、2-APB干預組ALP活性高于正常對照組和鎂干預組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖2)。

2.3 4組MGP mRNA及OPN mRNA的表達水平比較 培養(yǎng)14 d后，4組MGP mRNA和OPN mRNA的表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=1 279.905、1 157.247，P<0.05)；鎂干預組MGP mRNA和OPN mRNA的表達水平高于高磷組及2-APB干預組 (P<0.05，見圖3)。動態(tài)觀察MGP mRNA和OPN mRNA的表達變化，結(jié)果顯示在培養(yǎng)第3天時，高磷組MGP mRNA和OPN mRNA表達水平均降低(P<0.05)，并隨著時間的延長呈下降趨勢；鎂干預組MGP mRNA和OPN mRNA表達水平均升高(P<0.05)，并隨著時間的延長呈上升趨勢(見圖4)。

注：ALP=堿性磷酸酶；A為正常對照組，B為高磷組，C為鎂干預組，D為2-APB干預組；與正常對照組比較，△P<0.05；與鎂干預組比較，▲P<0.05

圖2 培養(yǎng)14 d后4組細胞鈣水平及ALP活性的比較

Figure 2 Comparison of the calcium levels and ALP activity in the four groups after incubation for 14 days

注：MGP=基質(zhì)G蛋白，OPN=骨橋蛋白；A為正常對照組；B為高磷組；C為鎂干預組；D為2-APB干預組；與鎂干預組比較，△P<0.05

圖3 培養(yǎng)14 d后4組MGP mRNA及OPN mRNA的表達水平比較

Figure 3 Comparison of the expression of MGP mRNA and OPN mRNA in the four groups after incubation for 14 days

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與高磷組比較，○P<0.05

圖4 不同時間段MGP mRNA和OPN mRNA的表達水平比較

Figure 4 Comparison of the expression of MGP mRNA and OPN mRNA in the four groups in different time

3 討論

血管鈣化在慢性腎臟病患者中普遍存在，研究表明與慢性腎臟病相關(guān)的鈣化主要是血管中膜鈣化[5]，其主要表現(xiàn)為血管壁僵硬度增加，順應性減低，從而引起心肌缺血、心力衰竭，是導致慢性腎臟病患者心血管高發(fā)病率和高病死率的重要原因之一。鎂離子作為人體所必需的重要元素，具有重要的生理功能，如作為酶的輔助因子調(diào)節(jié)酶活性，同時還對血管壁內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞等多種細胞具有調(diào)節(jié)作用，因此鎂離子與血管鈣化的關(guān)系近年來受到人們的關(guān)注。Spiegel等[6]最近一項隨訪18個月的臨床研究發(fā)現(xiàn)，碳酸鎂可以阻止冠狀動脈鈣化的進展。筆者之前的基礎(chǔ)研究亦發(fā)現(xiàn)鎂離子對高磷誘導的血管鈣化有一定抑制作用[3]。本研究進一步向鎂干預組加入了鎂離子通道抑制劑，阻止鎂離子進入細胞，結(jié)果顯示2-APB干預組鈣水平高于鎂干預組，提示其明顯減弱了鎂離子對高磷誘導VSMCs鈣化的抑制作用，進一步證實鎂離子對VSMCs鈣化具有強效的拮抗作用。

然而，鎂離子抑制血管鈣化的具體機制目前尚不清楚。眾所周知，血管鈣化是類似于骨形成的高度可調(diào)控的細胞介導的主動過程[7]。研究表明，在血管鈣化形成過程中除鈣化相關(guān)促進因子(如骨源性相關(guān)因子)表達水平增加外，還伴有相關(guān)抑制因子表達水平的降低[4]。MGP廣泛分布于軟骨、心、血管及肺等組織中，是軟骨內(nèi)骨形成和血管內(nèi)異位鈣化的重要調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)，MGP基因敲除的小鼠模型出生后不久即出現(xiàn)嚴重血管鈣化，2個月后因動脈鈣化破裂而死亡[8]。MGP可與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2結(jié)合，拮抗其促進動脈鈣化的作用[9]。OPN是一種廣泛表達于骨、軟骨、腎臟等組織的分泌糖基化磷酸蛋白?，F(xiàn)有報道表明，OPN具有很強的抑制血管鈣化的作用，與僅缺乏MGP的小鼠相比，缺乏OPN及MGP兩種基因的小鼠更早出現(xiàn)動脈鈣化，并且動脈鈣化率是前者的2倍[10]。本研究表明，VSMCs鈣化伴隨MGP mRNA及OPN mRNA的表達水平下降，提示內(nèi)源性抗鈣化能力減弱在血管鈣化的發(fā)生中起重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，給予鎂離子干預后可明顯上調(diào)MGP mRNA及OPN mRNA的表達水平，而給予鎂通道抑制劑后這種效果即消失，提示鎂離子可增強內(nèi)源性抗鈣化能力來抑制鈣化；隨后動態(tài)觀察了鎂離子上調(diào)MGP及OPN的特點，結(jié)果顯示在培養(yǎng)第3天時，高磷組MGP mRNA和OPN mRNA表達水平均降低，并隨著時間的延長呈下降趨勢；鎂干預組MGP mRNA和OPN mRNA表達水平均升高，并隨著時間的延長呈上升趨勢，提示鎂離子增強內(nèi)源性抗鈣化系統(tǒng)的作用呈一定的時間依賴性。

總之，本研究進一步證實高濃度鎂離子對血管鈣化具有強效的抑制作用，而上調(diào)內(nèi)源性鈣化拮抗系統(tǒng)可能是其重要的作用機制之一。但本研究僅局限于體外細胞水平，而其在人體如何，尚有待進一步設(shè)計動物實驗及臨床試驗觀察鎂離子對血管鈣化相關(guān)鈣化因子表達水平的影響。

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修回日期：2014-12-21)

(本文編輯：李婷婷)

Effect of Magnesium on Factors Related to Calcification in Rat Vascular Smooth Muscle Cells

BAIYa-ling,XUJin-sheng,JINJing-jing,etal.

DepartmentofNephrology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

Objective To investigate the effect of magnesium on the expression of factors related to calcification in rat vascular smooth muscle cells (VSMCs).Methods A total of 6 healthy SD rats aged 5 weeks were selected.VSMCs were primarily cultured in vitro using tissue block adhering wall method,and the third to fifth generation was used for cell experiment.The VSMCs were randomly divided into control group,high phosphorus group (10 mmol/L β-glycerophosphate),magnesium intervention group (10 mmol/L β-glycerophosphate and 3 mmol/L MgSO4),2-APB intervention group (10 mmol/L β-glycerophosphate,3 mmol/L MgSO4and 10-4μmol/L 2-APB).After culturing for 14 days,calcification was detected with OCPC method and the activity of alkaline phosphatase was detected with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method.The expression of matrix gla protein (MGP) mRNA and osteopontin (OPN) mRNA on 0,3,6,10 and 14 days were detected by RT-PCR method.Results After culturing for 14 days,the four groups showed statistically significant differences in calcification level (F=409.800,P<0.05),with the high phosphorus group and 2-APB intervention group significantly higher than the control group and magnesium intervention group (P<0.05).The four groups showed statistically significant differences in ALP activity (F=490.901,P<0.05),with the high phosphorus group and 2-APB intervention group significantly higher than the control group and magnesium intervention group (P<0.05).The four groups showed statistically significant differences in the expression of MGP mRNA and OPN mRNA (F=1 279.905,1 157.247,P<0.05),with the magnesium intervention group significantly higher than the phosphorus group and 2-APB intervention group (P<0.05).Dynamic observation showed that the expression of MGP mRNA and OPN mRNA decreased after culturing for three days (P<0.05) and the decrease was in a time dependent manner.However,the expression of MGP mRNA and OPN mRNA in magnesium intervention group increased (P<0.05) in a time dependent manner.Conclusion Magnesium may up-regulate the expression of MGP and OPN in a time dependent manner in inhibiting the calcification of VSMCs,providing a reference for further clinical study.

Myocytes,smooth muscle；β-glycerophosphate;Magnesium；Vascular calcification；Matrix gla protein；Osteopontin

項目：河北省自然科學基金資助項目(H2012206157)

050011 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腎內(nèi)科

徐金升，050011 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腎內(nèi)科；E-mail：xjs5766@126.com

R 692.5

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.06.013

2014-09-21；