龍 彥,劉 暢,孫媛媛,趙曉濤,王 輝
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·短篇論著·
EB病毒急性感染的實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)診斷方法研究
龍 彥,劉 暢,孫媛媛,趙曉濤,王 輝
目的 對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)測定EB病毒衣殼抗原IgM(EBV-VCA IgM)的結(jié)果進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià),并與酶聯(lián)熒光分析法(ELFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)診斷EB病毒(EBV)急性感染的效能進(jìn)行比較。方法 選取2011年5月—2012年10月北京大學(xué)人民醫(yī)院不明原因發(fā)熱患者142例,對(duì)受試者使用分離膠真空采血管抽取靜脈血3 ml,分離血清,采用CLIA、ELFA和ELISA檢測EBV-VCA IgM,比較3種方法診斷EBV急性感染的價(jià)值;并對(duì)CLIA進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果 CLIA低、中和高值(分別為25.8、81.8、184.4 U/ml)血清標(biāo)本批內(nèi)變異系數(shù)(CV)分別為5.7%、3.9%和2.6%,批間CV分別為11.4%、5.4%和4.2%。理論值與實(shí)測值間的回歸方程為Y=0.090 4+1.005 2X,相關(guān)系數(shù)r=0.998(P<0.001),回收率為95.3%~104.8%;當(dāng)標(biāo)本中血紅蛋白水平達(dá)8 g/L,三酰甘油達(dá)30 000 mg/L時(shí),均不干擾CLIA。CLIA診斷EBV急性感染的靈敏度為94.2%,特異度為91.1%,Youden′s指數(shù)為0.853;ELFA診斷EBV急性感染的靈敏度為82.7%,特異度為88.9%,Youden′s指數(shù)為0.716,;ELISA診斷EBV急性感染的靈敏度為80.8%,特異度為91.1%,Youden′s指數(shù)為0.719。CLIA診斷EBV急性感染ROC曲線下面積(AUC)為0.962〔SE=0.021,95%CI(0.920,1.004)〕;ELFA診斷EBV急性感染的AUC為0.960〔SE=0.015,95%CI(0.911,0.990)〕;ELISA診斷EBV急性感染的AUC為0.882〔SE=0.031,95%CI(0.823,0.942)〕。ROC曲線顯示,CLIA診斷EBV急性感染的最佳診斷界值為41 U/ml,靈敏度為96.2%,特異度為99.7%,Youden′s指數(shù)為0.959。結(jié)論 CLIA是目前測定EBV-VCA IgM較靈敏的定量檢測方法,優(yōu)于ELFA和ELISA,適用于臨床EBV感染的早期診斷。
愛潑斯坦巴爾病毒感染;發(fā)光測定法;酶聯(lián)免疫吸附測定;酶聯(lián)熒光分析法
龍彥,劉暢,孫媛媛,等.EB病毒急性感染的實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)診斷方法研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2015,18(5):582-584,587.[www.chinagp.net]
Long Y,Liu C,Sun YY,et al.Research of laboratory serological diagnostic method for acute EB virus infection[J].Chinese General Practice,2015,18(5):582-584,587.
EB病毒(EBV)屬皰疹類病毒之一,人類對(duì)EBV普遍易感,成人EBV感染率高達(dá)90%[1],人體感染EBV后病情輕重不一,多數(shù)患者癥狀輕微,但嚴(yán)重時(shí)可累及全身各臟器系統(tǒng),甚至出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥而危及生命[2],因此,及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷EBV急性感染至關(guān)重要。EBV衣殼抗原IgM抗體(EBV-VCA IgM)在EBV感染急性期出現(xiàn),可持續(xù)1~2個(gè)月,對(duì)診斷EBV急性感染意義重大[1]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法是目前實(shí)驗(yàn)室用于EBV-VCA IgM檢測較為廣泛的方法,但ELISA法受不同試劑廠商、實(shí)驗(yàn)室條件、操作人員影響較大,多手工操作,且只能進(jìn)行定性或半定量檢測,靈敏度有待提高,在一定程度上給臨床早期診斷、監(jiān)測病情帶來一定困難[2]。酶聯(lián)熒光分析法(ELFA)在一定程度上提高了EBV-VCA IgM檢出的靈敏度[3],但成本較高。本研究對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)用于EBV-VCA IgM定量檢測價(jià)值行方法學(xué)評(píng)價(jià),并與ELFA、ELISA法相比,進(jìn)一步驗(yàn)證CLIA檢測EBV-VCA IgM臨床應(yīng)用的有效性。
1.1 研究對(duì)象 選取2011年5月—2012年10月北京大學(xué)人民醫(yī)院不明原因發(fā)熱患者142例,其中男69例,女73例;年齡3~67歲。EBV急性感染的診斷金標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)出現(xiàn)發(fā)熱、咽峽炎、淋巴結(jié)及肝脾大,外周血淋巴細(xì)胞數(shù)增多,異常淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)10%以上或血清嗜異性凝集反應(yīng)陽性[4]。對(duì)受試者使用分離膠真空采血管抽取靜脈血3 ml,避免飽餐后采血,以3 000 r/min在離心機(jī)中離心3 min,離心半徑為10 cm,分離血清,48 h內(nèi)完成檢測者置于4 ℃保存?zhèn)溆?,否則置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2 主要儀器及試劑 CLIA采用Liaison全自動(dòng)CLIA儀(意大利,Diasorin公司),全封閉配套試劑包括包被有EBV衣殼抗原(p18多肽)的磁性微粒、結(jié)合異魯米諾衍生物的鼠抗人IgM抗體、高值和低值定標(biāo)液、激發(fā)液和緩沖液;ELFA為美國生物梅里埃公司提供的Vidas操作系統(tǒng)及其配套試劑(包被抗原VCA的多肽片段p18多肽);ELISA法測定EBV-VCA IgM的試劑盒為歐蒙(德國)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份有限公司產(chǎn)品。
1.3 檢測方法 CLIA測定:測定原理是在磁性微粒表面包被有p18多肽,如果待測血清中含有EBV-VCA IgM,則可與之結(jié)合,然后加入異魯米諾衍生物的鼠抗人IgM的結(jié)合物,孵育后洗去未與固相載體結(jié)合物。加入激發(fā)液啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng),光信號(hào)強(qiáng)度與EBV-VCA IgM的濃度成正比。標(biāo)本測定在Liaison全自動(dòng)CLIA儀上完成,以>40 U/ml為陽性。每次檢測前進(jìn)行光路校正和質(zhì)控。
ELFA測定:試劑盒SPR管內(nèi)包被有捕獲IgM的抗IgM抗體,通過液體培養(yǎng)基內(nèi)穩(wěn)定的抗原(VCA-p18)檢測IgM的存在,經(jīng)第1次孵育后洗去多余的抗體,再次加入針對(duì)穩(wěn)定抗原的經(jīng)底物4-甲基傘形的磷酸鹽(4MU)標(biāo)記的抗體,底物經(jīng)堿性磷酸酶水解作用后形成4-甲基傘形酮,傘形酮熒光在370 nm激發(fā),在450 nm測定,測定的熒光強(qiáng)度與標(biāo)本中的抗體濃度成正比。標(biāo)本測定在Vidas全自動(dòng)CLIA儀上完成,TV>0.19為陽性。每次標(biāo)本測定前均進(jìn)行定標(biāo)和質(zhì)控。
ELISA法測定:雙抗夾心法,操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。每次檢測在加樣同時(shí)加入定標(biāo)液和陰、陽性對(duì)照。結(jié)果以標(biāo)本的吸光度與定標(biāo)液吸光度比值(S/CO)≥1.0為陽性,<1.0為陰性。
1.4 CLIA方法學(xué)評(píng)價(jià) 精密度測試:取低、中、高值血清(分別為25.8、81.8、184.4 U/ml),分別重復(fù)測定20次,計(jì)算變異系數(shù)(CV),反映批內(nèi)精密度;各水平的混合血清測定2次/d,連續(xù)10 d,共20次,評(píng)價(jià)批間精密度。
準(zhǔn)確度測試:采用Liaison EBV-VCA IgM檢測試劑配套的稀釋液,將中、高值混合血清經(jīng)1∶2至1∶32稀釋后做CLIA測定,計(jì)算回收率,并進(jìn)行實(shí)測值和理論值間的線性回歸分析。
干擾試驗(yàn):取中值血清分別加入定量的血紅蛋白、三酰甘油,測定EBV-VCA IgM濃度。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,繪制ROC曲線并計(jì)算Youden′s指數(shù),比較3種方法診斷EBV急性感染的靈敏度、特異度以及ROC曲線下面積(AUC),評(píng)價(jià)不同方法的診斷效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 精密度 低、中和高值標(biāo)本批內(nèi)CV分別為5.7%、3.9%和2.6%,批間CV分別為11.4%、5.4%和4.2%。
2.2 準(zhǔn)確度 理論值與實(shí)測值間的回歸方程為Y=0.090 4+1.005 2X,相關(guān)系數(shù)r=0.998(P<0.001),回收率為95.3%~104.8%(見表1),表明測定結(jié)果與理論值具有良好的一致性。
表1 EBV-VCA IgM檢測回收率測定結(jié)果
Table 1 The results of recoveries of EBV-VCA IgM by CLIA
稀釋倍數(shù)中值理論值(U/ml)實(shí)測值(U/ml)回收率(%)高值理論值(U/ml)實(shí)測值(U/ml) 回收率(%)原濃度-824--1846-1∶241243210489238919651∶420619795446247310241∶8103106103123124210481∶1652519861151139841∶32262595358556958
注:-為無此數(shù)值
2.3 干擾試驗(yàn) 當(dāng)標(biāo)本中血紅蛋白水平達(dá)8 g/L,三酰甘油達(dá)30 000 mg/L時(shí),均不干擾CLIA檢測結(jié)果,且對(duì)于常用抗凝劑如肝素(500 U/ml)、乙二胺四乙酸(EDTA)(1.8 mg/ml)及枸櫞酸鹽(3.2%枸櫞酸鉀,1∶9)等,在正??鼓齽┯昧繒r(shí)對(duì)檢測結(jié)果均未見明顯影響。
2.4 CLIA、ELFA和ELISA診斷EBV急性感染的效能比較 CLIA診斷EBV急性感染的靈敏度為94.2%,特異度為91.1%,Youden′s指數(shù)為0.853;ELFA診斷EBV急性感染的靈敏度為82.7%,特異度為88.9%,Youden′s指數(shù)為0.716,;ELISA診斷EBV急性感染的靈敏度為80.8%,特異度為91.1%,Youden′s指數(shù)為0.719(見表2~4)。
表2 CLIA對(duì)EBV急性感染的診斷效能
Table 2 Diagnostic efficacy of CLIA on acute EBV infection
CLIA金標(biāo)準(zhǔn)EBV急性感染 非EBV急性感染合計(jì)陽性49857陰性38285合計(jì)5290142
注:EBV=EB病毒,CLIA=化學(xué)發(fā)光免疫分析法
表3 ELFA對(duì)EBV急性感染的診斷效能
Table 3 Diagnostic efficacy of ELFA on acute EBV infection
ELFA金標(biāo)準(zhǔn)EBV急性感染非EBV急性感染合計(jì)陽性431053陰性98089合計(jì)5290142
注:ELFA=酶聯(lián)熒光分析法
表4 ELISA對(duì)EBV急性感染的診斷效能
Table 4 Diagnostic efficacy of ELISA on acute EBV infection
ELISA金標(biāo)準(zhǔn)EBV急性感染非EBV急性感染合計(jì)陽性42850陰性108292合計(jì)5290142
注:ELISA=酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
CLIA診斷EBV急性感染的AUC為0.962〔SE=0.021,95%CI(0.920,1.004)〕;ELFA診斷EBV急性感染的AUC為0.960〔SE=0.015,95%CI(0.911,0.990)〕;ELISA診斷EBV急性感染的AUC為0.882〔SE=0.031,95%CI(0.823,0.942)〕(見圖1)。ROC曲線顯示,CLIA診斷EBV急性感染的最佳診斷界值為41 U/ml,靈敏度為96.2%,特異度為99.7%,Youden′s指數(shù)為0.959;ELFA診斷EBV急性感染的最佳診斷界值為0.19,靈敏度為88.5%,特異度為98.9%,Youden′s指數(shù)為0.874;ELISA診斷EBV急性感染的最佳診斷界值是1.0,靈敏度為82.7%,特異度為86.7%,Youden′s指數(shù)為0.694。
圖1 3種方法診斷EBV急性感染的ROC曲線
Figure 1 ROC curve of CLIA,ELFA and ELISA on diagnosing the acute EBV infection
EBV屬于雙鏈DNA病毒,人是其唯一天然宿主。人在感染EBV后,可引起特異性的淋巴組織增生性疾病,臨床癥狀多不典型,表現(xiàn)形式多樣,主要與傳染性單核細(xì)胞增多癥、Burkitt淋巴瘤及鼻咽癌等有關(guān),因此,其診斷需要依賴于實(shí)驗(yàn)室檢查。本病毒難以分離培養(yǎng),給臨床診斷帶來困難。血清學(xué)抗體檢測是目前臨床診斷EBV急性感染的主要依據(jù)之一[5],其中以EBV-VCA IgM最為常用,在EBV急性感染后最早出現(xiàn),隨后產(chǎn)生EBV-VCA IgG,部分人群可能出現(xiàn)一過性的EA-IgG。EBV-VCA IgM在發(fā)病后出現(xiàn)早、消失快,具有較高的敏感度和特異度,臨床常用于EBV急性感染的早期診斷[6]。國內(nèi)主要采用ELISA法檢測[3,7],需手工操作,且各試劑廠商間差異較大,靈敏度較低,尤其針對(duì)EBV感染早期或免疫功能缺陷患者,如骨髓移植后及自身免疫疾病患者等,此類患者自身免疫系統(tǒng)抑制或缺陷,同時(shí)使用免疫抑制劑,機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的水平相對(duì)較低,ELISA法的靈敏度較低,可能導(dǎo)致此類患者漏檢,ELIFA檢測的臨床應(yīng)用文獻(xiàn)報(bào)道不一[3,7]。因此,需要靈敏度更好的方法檢測體內(nèi)低水平的抗體含量。CLIA利用抗原-抗體反應(yīng)及磁珠放大系統(tǒng),其靈敏度高,特異度亦與ELISA法相當(dāng)[8],采用CLIA可顯著提高對(duì)免疫抑制或缺陷患者EBV-VCA IgM的檢出率,本研究結(jié)果亦顯示,CLIA檢測的批內(nèi)及批間CV均<5%,同時(shí)具有良好的抗干擾能力,溶血、脂血對(duì)其測定影響小。相比其他檢測方法,CLIA的操作更為簡便、結(jié)果判斷不受主觀因素的影響,且完全實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。
本研究結(jié)果顯示,CLIA的AUC大于ELFA和ELISA(0.962>0.960>0.882)。在最佳診斷界值時(shí),CLIA的靈敏度和特異度均高于ELFA和ELISA,但低于國外報(bào)道的98.7%和97.3%[9-10],可能與本研究EBV急性感染患者部分為骨髓移植后及與自身免疫疾病有關(guān),此外,地域性差異亦可能導(dǎo)致此類情況的產(chǎn)生。本研究依據(jù)CLIA ROC曲線得到最佳診斷界值為41 U/ml,與實(shí)際應(yīng)用>40 U/ml近似,因此,以>40 U/ml作為界值,可應(yīng)用于臨床。
綜上,與ELFA、ELISA法相比,CLIA用于臨床檢測EBV-VCA IgM具有簡便、快速,靈敏度和特異度較好,且可進(jìn)行定量檢測,有助于提高臨床EBV急性感染的診斷。
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注:BMI=體質(zhì)指數(shù),LVEF=左心室射血分?jǐn)?shù),Scr=血肌酐,BUN=尿素氮
表2 3組基本資料比較〔n(%)〕
注:CHD=冠心病
表3 3組患者手術(shù)前后血清Cys-C水平比較
注:與術(shù)前1天比較,*P<0.05;與對(duì)照組比較,△P<0.05
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(收稿日期:2014-09-20;
修回日期:2014-12-14)
(本文編輯:賈萌萌)
Research of Laboratory Serological Diagnostic Method for Acute EB Virus Infection
LONGYan,LIUChang,SUNYuan-yuan,etal.
DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUniversityPeople′sHospital,Beijing100044,China
Objective To appraise the methodology of anti EBV-VCA IgM assay by CLIA and compare its diagnostic effect of acute EBV virus infection with ELFA and ELISA.Methods 142 cases of origin-unknown fever in Peking University People′s Hospital from May,2011 to October,2012 were selected as the research subjects.3 ml of venous blood was drawn with separation gel vacuum collective tube and blood serum was separated for detecting EBV-VCA IgM by CLIA,ELFA and ELISA.The diagnostic effects of the three methods were compared and methodology evaluation was then performed for the detection by CLIA.Results The coefficients of variation(CV)of low,middle and high value of CLIA(25.8,81.8,184.4 U/ml)in one batch inside were 5.7%,3.9% and 2.6% respectively and in different batches separately were 11.4%,5.4% and 4.2% respectively.The regression equation between expected values and measured values was Y=0.090 4+1.005 2X (r=0.998,P<0.001)and the recovery rate was 95.3%-104.8%;hemoglobin level reaching 8 g/L and triglyceride reaching 30 000 mg/L did not interfere with CLIA.The sensitivity of CLIA,ELFA and ELISA in diagnosing acute EBV infection were 94.2%,82.7% and 80.8% separately,the specificity of the three were 91.1%,88.9% and 91.1% separately and the Youden′s index were 0.853,0.716 and 0.719 separately.The AUC of CLIA for diagnosing acute EBV infection was 0.962〔SE=0.021,95%CI(0.920,1.004)〕,the AUC of ELFA and ELISA were 0.960〔SE=0.015,95%CI(0.911,0.990)〕and 0.882〔SE=0.031,95%CI(0.823,0.942)〕respectively.ROC curve showed that the best diagnostic threshold was 41 U/ml,the sensitivity was 96.2%,specificity was 99.7% and Youden′s index was 0.959.Conclusion CLIA is a more sensitive quantitative method for EB-VCA IgM detection,and is superior to ELFA and ELISA.It is suitable for the early clinical diagnosis of acute EBV infection.
Epstein-barr virus infections;Luminescent measurements;Enzyme-linked immunosorbent assay;Enzyme-linked fluorescent assay
100044北京市,北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科
趙曉濤,100044北京市,北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科;E-mail:zhaoxt@bjmu.edu.cn
R 512.99
B
10.3969/j.issn.1007-9572.2015.05.022
2014-09-21;< class="picture_table_title">修回日期:2014-12-30) (本文編輯:賈萌萌)
2014-12-30) (本文編輯:賈萌萌)
Table1Comparisonofgeneraldataamong3groups
組別例數(shù)年齡(歲)BMI(kg/m2)LVEF(%)Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)對(duì)照組20557±60216±2158±7654±15162±16未接受PCI組30552±60214±2758±7577±13563±14PCI組30539±73216±2657±7571±13661±16F值03370622003907140470P值07150540096104930627