云長纓，吳多榮，黃 會，黃增光，佘姝敏

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泌尿系感染多重耐藥腸桿菌科細菌分子流行病學分析

云長纓，吳多榮，黃 會，黃增光，佘姝敏

目的 了解海南地區(qū)泌尿系感染多重耐藥腸桿菌科細菌的流行特點及耐藥機制。方法 收集海南地區(qū)4家三級綜合醫(yī)院(海南省人民醫(yī)院、?？谑腥嗣襻t(yī)院、海南農墾總局醫(yī)院和三亞市人民醫(yī)院)2012年1月—2013年8月門診和住院泌尿系感染患者清潔中段尿分離的多重耐藥腸桿菌科細菌225株，采用VITEK 2 compact微生物分析儀進行細菌鑒定和藥敏試驗，采用確證試驗檢測超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)，采用改良Hodge試驗(MHT)和金屬酶篩選(MBL)試驗對碳青霉烯類不敏感菌株進行碳青霉烯酶表型確認，對于陽性菌株采用PCR擴增分別進行ESBLs、KPC酶、IPM酶和NDM-1基因型檢測，并對擴增產物進行測序。結果 225株多重耐藥腸桿菌科細菌中產ESBLs的細菌203株(90.2%)，其中大腸埃希菌163株、肺炎克雷伯菌32株、產酸克雷伯菌4株、奇異變形桿菌4株；其他多重耐藥腸桿菌科細菌22株(9.8%)。藥敏試驗發(fā)現(xiàn)對碳青霉烯類不敏感的細菌有26株，行MHT有11株陽性，MBL試驗有8株陽性。經PCR擴增對陽性菌株進行基因檢測，結果3株攜帶KPC-2基因，5株攜帶NDM-1基因，1株攜帶IPM-4基因。ESBLs基因型中TEM型占60.1%(122/203)、CTX-M型占46.3%(94/203)、SHV型占15.8%(32/203)，有39株細菌同時擴增出2種及以上基因型。結論 海南地區(qū)泌尿系感染多重耐藥腸桿菌科細菌主要以產ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主，流行的基因型以TEM型多見，其次是CTX-M型和SHV型；已發(fā)現(xiàn)少量對碳青霉烯類不敏感菌株，其主要耐藥機制為產生NDM-1、KPC-2、IPM-4基因，臨床上應引起重視，嚴格做好預防和控制工作。

泌尿系疾??；腸桿菌科感染；分子流行病學

云長纓，吳多榮，黃會，等.泌尿系感染多重耐藥腸桿菌科細菌分子流行病學分析[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(11)：1322-1325，1329.[www.chinagp.net]

Yun CY，Wu DR，Huang H，et al.Urinary system infection of multidrug-resistant enterobacteriaceae:a molecular epidemiology analysis[J].Chinese General Practice，2015，18(11)：1322-1325，1329.

泌尿系感染是臨床常見的感染之一[1]，最常見的病原菌是腸桿菌科細菌，其中大腸埃希菌尤為多見[2]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，腸桿菌科細菌的多重耐藥現(xiàn)象在臨床上已非常多見[3-4]。這給臨床泌尿系感染的治療帶來了很大的困難，其主要耐藥機制為產生超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)、IPM酶、KPC酶以及NDM-1等多種耐藥酶[5]。為全面了解海南地區(qū)泌尿系感染多重耐藥腸桿菌科細菌的分子流行病學特點及耐藥機制，現(xiàn)對2012年1月—2013年8月收集的225株多重耐藥腸桿菌科細菌的分子流行病學特點回顧分析如下。

1 材料與方法

1.1 納入與排除標準 納入標準：門診和住院泌尿系感染患者清潔中段尿培養(yǎng)鑒定為腸桿菌科細菌，菌落計數(shù)>10萬/ml，且大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌和奇異變形桿菌藥敏結果顯示為ESBLs陽性，其他腸道桿菌顯示對3類或3類以上抗菌藥物耐藥。排除標準：同一患者相同部位或不同部位檢出相同細菌，只收集第1株細菌納入研究，不重復收集。

1.2 材料

1.2.1 菌株來源 收集海南地區(qū)4家三級綜合醫(yī)院(海南省人民醫(yī)院、海口市人民醫(yī)院、海南農墾總局醫(yī)院和三亞市人民醫(yī)院)2012年1月—2013年8月門診和住院泌尿系感染患者清潔中段尿分離的多重耐藥腸桿菌科細菌225株，其中男104名，女12名；年齡4個月～95歲。

1.2.2 儀器與試劑 VITEK 2 compact微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)，PCR儀為veriti 96-well thermal cycle(applied biosystems，USA)，電泳儀為powerpac basic(bio-red，USA)，離心機為neofuge 13(healforce,中國)，水浴鍋HH-6(江蘇金壇榮華儀器制造有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc 2000(bio-red，USA)，HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)，電泳槽(北京六一儀器廠)。主要試劑：ExTaq Mix與 DNA Marker( D2000) 均購自寶生物工程公司，所有引物由北京六合華大基因有限公司合成，VITEK 2 compact GN鑒定卡和藥敏卡購自法國生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌鑒定和藥敏試驗 所有菌株采用VITEK 2 compact微生物分析儀GN鑒定卡和藥敏卡進行鑒定和藥敏試驗，質控菌株大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)。

1.3.2 ESBLs檢測 采用確證試驗檢測ESBLs，按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)2012年(M100-S22版)推薦的方法進行[6]。

1.3.3 改良Hodge試驗(MHT)和金屬酶篩選(MBL)試驗[7]采用MHT和MBL試驗對碳青霉烯類不敏感菌株進行碳青霉烯酶表型確認。MHT陽性質控菌株ATCC BAA-1705，陰性質控菌株ATCC BAA-1706。用亞胺培南/EDTA復合E-test藥敏試條協(xié)同試驗測定最小抑菌濃度(MIC)，單藥與復合制劑的MIC比值≥8即可判定產金屬酶。

1.3.4 PCR擴增與測序

1.3.4.1 菌株DNA模板的提取 菌株DNA模板的提取采用煮沸法：將菌株置于M-H培養(yǎng)基上，放入HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(37 ℃)中培養(yǎng)16～18 h，取綠豆大小的菌苔置于含有1 ml超純水的EP管中，混勻，置于沸水中煮沸10 min后，立即放于冰上5 min，然后以離心半徑8 cm，12 000 r/min離心10 min，取上清液于新的EP管中，即為PCR模板。

1.3.4.2 引物設計 根據Genbank公布的基因序列，利用引物設計軟件Primer 5.0設計引物。引物序列詳見表1。

表1 PCR擴增基因引物序列

1.3.4.3 PCR擴增 采用特異引物進行PCR擴增及產物測序，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并拍照。PCR 產物測序由北京六合華大基因有限公司完成。測序結果在NCBI數(shù)據庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對確定基因型。

2 結果

2.1 菌株資料 清潔中段尿分離的225株多重耐藥腸桿菌科細菌中社區(qū)感染(門診或入院48 h內清潔中段尿培養(yǎng)陽性)占25.8%(58株)，院內感染(入院48 h后清潔中段尿培養(yǎng)陽性)占74.2%(167株)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=105.61，P<0.01)。主要分離科室為泌尿外科45株(20.0%)，其次是神經外科28株(12.4%)，門急診25株(11.1%)，其他科室127株(56.4%)。產ESBLs的細菌203株(90.2%)，分別是大腸埃希菌163株、肺炎克雷伯菌32株、產酸克雷伯菌4株、奇異變形桿菌4株；其他多重耐藥腸桿菌科細菌22株(9.8%)，分別為陰溝腸桿菌9株、弗勞地枸櫞酸桿菌6株、聚團腸桿菌2株、產氣腸桿菌2株、粘質沙雷菌2株、解鳥氨酸克雷伯菌1株。

2.2 藥敏試驗結果 225株多重耐藥腸桿菌科細菌藥敏試驗結果顯示，耐藥率>40%的藥物有氨曲南(ATM)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢曲松(CRO)、慶大霉素(CN)、環(huán)丙沙星(CIP)和左氧氟沙星(LEV)；耐藥率<10%的藥物有亞胺培南(IPM)、厄他培南(ETP)、美洛培南(MEM)、阿米卡星(AN)、妥布霉素(TOB)和哌拉西林/他唑巴坦(TZP，見表2)。藥敏試驗結果顯示所有菌株對3類以上藥物耐藥，其中有26株細菌對IPM、ETP和MEM中介或耐藥(對碳青霉烯類不敏感)。

表2 多重耐藥腸桿菌科細菌的藥敏試驗結果(%)

注：ATM=氨曲南，F(xiàn)EP=頭孢吡肟，CAZ=頭孢他啶，CRO=頭孢曲松，IPM=亞胺培南，ETP=厄他培南，MEM=美洛培南，AN=阿米卡星，TOB=妥布霉素，CN=慶大霉素，CIP=環(huán)丙沙星，LEV=左氧氟沙星，TZP=哌拉西林/他唑巴坦，S=敏感，I=中介，R=耐藥

2.3 MHT和MBL試驗結果 對26株碳青霉烯類不敏感腸桿菌科細菌行MHT有11株陽性，MBL試驗有8株陽性(見圖1、2)。

注：MHT=改良Hodge試驗

圖1 MHT結果

Figure 1 The modified Hodge test

注：MBL試驗=金屬酶篩選試驗

圖2 MBL試驗結果

Figure 2 Metallo-β-lactamases test

2.4 ESBLs基因擴增結果 203株產ESBLs細菌中，122株(60.1%)擴增出TEM型基因，其中大腸埃希菌98株，肺炎克雷伯菌18株，產酸克雷伯菌3株，奇異變形桿菌3株；94株(46.3%)擴增出CTX-M型基因，其中大腸埃希菌79株，肺炎克雷伯菌10株，產酸克雷伯菌2株，奇異變形桿菌3株；32株(15.8%)擴增出SHV型基因，其中大腸埃希菌18株，肺炎克雷伯菌12株，產酸克雷伯菌2株；33株細菌同時擴增出2種基因，6株細菌同時擴增出3種基因(見圖3～5)。

圖3 TEM型電泳圖

2.5 碳青霉烯酶基因擴增結果 MHT陽性和MBL試驗陽性菌株經PCR檢測結果有3株攜帶KPC-2基因(弗勞地枸櫞酸桿菌、大腸埃希菌、產酸克雷伯菌各1株)；5株攜帶NDM-1基因(肺炎克雷伯菌2株，弗勞地枸櫞酸桿菌2株，產酸克雷伯菌1株)；1株攜帶IPM-4基因(產酸克雷伯菌，見圖6～8)。

圖6 KPC電泳圖

3 討論

革蘭陰性桿菌是泌尿系感染最多見的細菌，其中以大腸埃希菌較為多見，隨著ESBLs、KPC酶、IPM酶和NDM-1等各種耐藥酶的出現(xiàn)，臨床上細菌的多重耐藥現(xiàn)象已比較突出[3-4]。本研究收集的225株多重耐藥腸桿菌科細菌中，主要以產ESBLs的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌和奇異變形桿菌等菌株為主，可見產ESBLs是引起腸桿菌科細菌多重耐藥的主要因素。ESBLs分類屬于A類2組2be亞組，是腸桿菌科細菌對β-內酰胺類抗菌藥物的主要耐藥機制，其耐藥基因主要包括TEM、CTX-M、SHV型。

據國外報道，腸桿菌科細菌ESBLs基因型中TEM型占1.2%～2.2%，CTX-M型占70.9%～76.0%，SHV型占3.6%～26.8%[8-9]。國內TEM型占59.6%～86.3%，CTX-M型占35.5%～93.6%，SHV型占3.4%～27.5%[10]。本研究通過對203株產ESBLs細菌的基因型進行檢測，發(fā)現(xiàn)TEM型基因占60.1%，CTX-M型基因占46.3%，SHV型基因占15.8%，與國內水平相當，但與胥飚等[11]報道的明顯不同。其中有39株細菌同時擴增出2種及以上ESBLs基因，這與文獻報道多數(shù)產ESBLs菌株同時攜帶2種以上基因的結果相符[10，12]。由于產ESBLs大腸埃希菌的耐藥基因型流行具有復雜性和多樣化特點，且呈現(xiàn)區(qū)域性流行，不同地區(qū)必須加強監(jiān)測，為預防、控制和治療提供依據。

腸桿菌科細菌產IPM酶、KPC酶以及NDM-1是導致其對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因，本研究發(fā)現(xiàn)有26株細菌對碳青霉烯類藥物顯示中介或耐藥，通過對其進行碳青霉烯酶基因檢測，發(fā)現(xiàn)有5株攜帶NDM-1基因、1株攜帶IPM-4基因，攜帶菌株分別是肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌和弗勞地枸櫞酸桿菌，與國內外報道基本一致[13-16]。繼2007年我國學者Wei等[17]首次報道在浙江地區(qū)發(fā)現(xiàn)了產KPC-2酶的肺炎克雷伯菌后，KPC酶相繼在大腸埃希菌、粘質沙雷菌、枸櫞酸桿菌等其他腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)共有3株腸桿菌科細菌攜帶KPC-2基因，分別是弗勞地枸櫞酸桿菌、大腸埃希菌和產酸克雷伯菌。由此可見海南地區(qū)泌尿系感染細菌中已有產KPC酶、IPM酶和NDM-1的腸桿菌科細菌在流行傳播，各醫(yī)院應加強對該類菌株的預防和監(jiān)測工作。

隨著NDM-1的出現(xiàn)，細菌的多重耐藥問題已成為全球關注的熱點，WHO提出“抵御耐藥性”，我國也加強了病原學的檢測和細菌耐藥的監(jiān)測工作。本研究中院內感染的多重耐藥腸桿菌科細菌最多，明顯高于社區(qū)感染，可見院內感染是導致泌尿系感染多重耐藥腸桿菌科細菌的主要因素，這與文獻報道相符[18]。分離率較高的科室主要為泌尿外科和神經外科，可見泌尿系統(tǒng)疾病和因顱腦疾病長期住院是院內尿路感染的易感因素。在分離的產碳青霉烯酶細菌中全部為院內感染分離菌株，因此加強院內感染預防和控制，不斷規(guī)范抗菌藥物的合理使用，可以有效地降低多重耐藥細菌的流行和傳播。

總之，本研究顯示海南地區(qū)泌尿系感染多重耐藥腸桿菌科細菌主要以產ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主，流行的基因型以TEM型多見，其次是CTX-M型和SHV型；已發(fā)現(xiàn)少量對碳青霉烯類不敏感菌株，其主要耐藥機制為產生NDM-1、KPC-2、IPM-4基因，臨床上應引起重視，嚴格做好預防和控制工作。因本研究僅收集4家醫(yī)院標本納入研究，覆蓋面不廣，存在一定局限性，在后續(xù)研究中會擴大標本收集范圍，更加全面地了解NDM-1、KPC-2、IPM-4等基因在海南地區(qū)泌尿系感染腸桿菌科細菌中的流行現(xiàn)狀，以更好地為臨床抗感染治療提供幫助。

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(本文編輯：崔麗紅)

Urinary System Infection of Multidrug-resistant Enterobacteriaceae:A Molecular Epidemiology Analysis

YUNChang-ying，WUDuo-rong，HUANGHui，etal.

HaikouCenterforDiseaseControlandPrevention，Haikou571100,China

Objective To investigate the epidemic characteristics of urinary system infection of multidrug-resistant enterobacteriaceae and its resistance mechanisms in Hainan District.Methods A total of 225 multidrug-resistant enterobacteriaceae isolated from midstream urine specimens in outpatients and inpatients from January 2012 to August 2013 in Hainan District.An identification of bacteria and drug sensitive test were carried out with VITEK 2 compact microbial ananlyzers,extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) by confirmatory test,carbapenemase phenotype confirmation performed on carbapenems insensitive strains by modified Hodge test (MHT) and metallo-β-lactamases (MBL) test,ESBLs,KPC enzyme,IPM enzyme,NDM-1 genotypic testing performed on positive strains by PCR amplification and the amplified products sequenced.Results A total of 203 from 225 strains of multidrug-resistant enterobacteriaceae produced ESBLs (90.2%),including 163 strains of escherichia coli,32 strains of klebsiella pneumoniae,4 strains of klebsiella oxytoca,4 strains of proteus mirabilis,22 strains of others (9.8%).By drug sensitive test,there were 26 strains of carbapenems insensitive bacteria,11 strains were positive by MHT,8 were positive by MBL test.By genetic testing of PCR amplififcation,3 strains carried KPC-2 gene,5 carried NDM-1 gene,1 carried IPM-4 gene.In ESBLs genotypes,TEM accounted for 60.1% (122/203),CTX-M for 46.3% (94/203),SHV for 15.8% (32/203).39 strains amplified 2 or more genotypes at the same time.Conclusion In Hainan District,multidrug-resistant enterobacteriaceae in urinary tracts are mainly escherichia coli and klebsiella pneumoniae producing ESBLs,their epidemic genotypes are mainly TEM,followed by CTX-M and SHV.We have found a small amount of carbapenem-insensitive strains,their main resistance mechanisms are producing NDM-1,KPC-2 and IPM-4 genes,which should be paid attention to.

Urologic diseases；Enterobacteriaceae infections；Molecular epidemiology

?？谑兄攸c科技計劃項目(2012-070)

571100海南省海口市疾病預防控制中心(云長纓)；海口市人民醫(yī)院(吳多榮，黃會，佘姝敏)；廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院(黃增光)

吳多榮，570208海南省海口市人民醫(yī)院；E-mail：wuduorong@163.com

R 69

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.11.023

2014-06-10；

2014-10-25)