王琰，馬興銘，蘇韞

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730000；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州　730050；

3.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730000)

黃芪多糖對腦缺血再灌注大鼠腦組織Caspase-3表達(dá)及形態(tài)學(xué)的影響

王琰1，馬興銘1，蘇韞2

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州730050；

3.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

摘要：為了探討黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織Caspase-3表達(dá)及形態(tài)學(xué)的影響.選取SPF級Wistar大鼠72只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對照組、陽性藥物對照組、黃芪高劑量組、黃芪中劑量組、黃芪低劑量組，每組12只；采用改良線栓法建立大鼠腦缺血再灌注模型，各藥物組分別給予相應(yīng)藥物15 d，后處死檢測， HE染色觀察各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化法檢測各組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平.結(jié)果表明：假手術(shù)組大鼠Caspase-3表達(dá)較弱，模型組較假手術(shù)組明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，其余各組大鼠的Caspase-3表達(dá)均有顯著減少(P<0.05)，以黃芪多糖高劑量組大鼠尤為明顯.形態(tài)學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明模型組大鼠可見神經(jīng)元大片消失，間質(zhì)疏松，殘余細(xì)胞胞核固縮、染色質(zhì)凝聚，其余各組神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡的程度較模型組輕，以黃芪高劑量組效果明顯.說明黃芪多糖能顯著抑制腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其作用可能是通過降低Caspase-3的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，且作用效果呈劑量依賴性.

關(guān)鍵詞：大鼠；腦缺血再灌注；黃芪多糖；Caspase-3；凋亡

第一作者：王琰(1977-)，男，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥免疫學(xué)及輔助生殖技術(shù).E-mail：ailya23@126.com

Effects of Astragalus Polysaccharides on Caspase-3 expression

and morphology in rats brain tissue after cerebral

ischemia reperfusion

WANG Yan1,MA Xing-ming1，SU Yun2

(1.College of Basic Medical Sciences,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China;2.Gansu Provincial

Maternity and Child Care Hospital,Lanzhou 730070,China;3.Gansu University of

Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China)

Abstract：In order to study the effects of Astragalus polysaccharides on Caspase-3 expression and morphology in rats brain tissue after cerebral ischemia reperfusion,72 SPF level Wistar rats were randomly divided into 6 groups,sham operation group,model group,positive control group,Astragalus polysaccharides high dose group,Astragalus polysaccharides middle dose group and Astragalus polysaccharides low dose group,12 rats in each group.With modified thread embolism method,the cerebral ischemia reperfusion models of rats were established.Each drug group was respectively given corresponding medicine for 15 days,and was detected after put to death.The changes of rats brain tissue in each group were observed by HE staining,and the expression level of Caspase-3 protein in rats brain tissues were detected with immunohistochemical method.The results showed that Caspase-3 expression was weak in artificial surgery group,which was much stronger in model group (P<0.01).Compared with model group,Caspase-3 expression amount of other groups were obviously less (P<0.05,P<0.01),particularly in Astragalus polysaccharides high dose group.The morphological changes in model group appeared obvious apoptosis,neurons disappear,mesenchyme loosen,karyopyknosis and chromatin condensation,nerve cell apoptosis of other groups were less worse than that of model group,especially obvious in Astragalus polysaccharides high dose group.The study showed that Astragalus polysaccharide could significantly inhibited nerve cell apoptosis,this should be realized by reducing the expression of Caspase-3,and the inhibition effect was dose-dependent.

Key words：rat;cerebral ischemia reperfusion;Astragalus polysaccharides;Caspase-3;apoptosis

近年來，人們對腦缺血再灌注損傷進(jìn)行了廣泛深入的研究，發(fā)現(xiàn)蛋白酶激活、基因表達(dá)的改變、興奮性氨基酸的釋放、鈣超載、蛋白合成受抑、熱休克蛋白表達(dá)受阻、自由基形成等過程都參與了腦缺血再灌注后神經(jīng)元的凋亡，但其詳細(xì)機(jī)制仍未完全明確.有研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3蛋白參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的病理過程，在腦缺血中再灌注損傷起重要的作用[1].黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫等功效[2].可作為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑，同時(shí)具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、促進(jìn)抗體合成、雙向調(diào)節(jié)血糖和保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床[3].

本試驗(yàn)旨在通過研究黃芪多糖對大鼠腦缺血再灌注后腦組織Caspase-3表達(dá)及腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，來推測黃芪多糖可能的藥理作用機(jī)制，以期為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù).

1試驗(yàn)材料

1.1試驗(yàn)動物

SPF級Wistar大鼠72只，體質(zhì)量(300±30)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供，動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證號：SYXK(甘)2011-0001，試驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：SCXK(甘)2011-0001-0001343.

1.2試驗(yàn)試劑

兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體(BA2142)(武漢博士德生物工程有限公司，批號201203)；SABC(兔IgG)免疫組化試劑盒(SA1022)(武漢博士德生物工程有限公司，批號201203)；DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號201203).

1.3試驗(yàn)藥物

黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心藥物提取與分離實(shí)驗(yàn)室提供，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心藥物鑒定實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)并鑒定，其純度達(dá)到50%以上.對照藥物：尼莫地平，浙江仙琚制藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H33021207，批號110810.青霉素，華北制藥股份有限公司，批號110912.

1.4試驗(yàn)儀器

CX31型生物顯微鏡(日本Olympus optical Co.LTD)；山東易創(chuàng)MiE圖像處理系統(tǒng)(山東易創(chuàng)電子有限公司)；成都泰盟BI-2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司).

2試驗(yàn)方法

2.1動物分組

72只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，假手術(shù)組、陽性對照組、腦缺血再灌注模型組、黃芪多糖高劑量組、中劑量組、小劑量組，每組12只.

2.2給藥劑量及方法

黃芪多糖給藥劑量：高劑量組120 mg/kg；中劑量組60 mg/kg；低劑量組30 mg/kg；臨用前分別用生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的溶液，配藥濃度：高劑量1.2%，中劑量0.6%，低劑量0.3%.陽性對照組給予尼莫地平，給藥劑量為5 mg/kg，用生理鹽水溶液配制.假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，各組分別連續(xù)給藥15 d.

2.3動物模型制備及取材

采用ZeaLonga等[4]報(bào)道的線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血再灌注模型.自頸總動脈分叉處向頸內(nèi)動脈插入栓線約(18.5±0.5)mm，阻斷大腦中動脈血流，造成局灶性腦缺血.術(shù)后將栓線尾部置于皮下，于6 h后小心抽出栓線實(shí)現(xiàn)缺血再灌注.假手術(shù)組頸內(nèi)動脈也插入栓線，但深度僅為6 mm，不阻塞大腦中動脈.麻醉清醒后，參照Longa方法進(jìn)行5分制評分，達(dá)1～3分入組.手術(shù)過程中，環(huán)境溫度保持于(25.0±0.5)℃，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉鹽，40 000 U/d，連續(xù)注射3 d，以預(yù)防感染發(fā)生.

造模后24 h對大鼠神經(jīng)功能評分，參考Longa及Bederson[5]評定神經(jīng)功能缺損程度的5級4分法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，評分為1～3分者，提示模型成功.

各組大鼠按造模給藥后第16天稱質(zhì)量后處死，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，分別用0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛溶液心臟灌注后固定腦組織，以前囟為中心前后1 mm(病變損害的中心)，冠狀切取大鼠腦組織，并用4%多聚甲醛溶液4 ℃固定24 h以上切取約3～4 mm厚的腦組織，常規(guī)用石蠟包埋，5 μm切片，HE染色，免疫組化法檢測Caspase-3蛋白.

2.4圖像分析

用光學(xué)顯微鏡(400倍)觀察每視野中凋亡細(xì)胞數(shù)目，Caspase-3陽性反應(yīng)為棕黃色，位于胞漿的棕色核并有凋亡小體出現(xiàn)的細(xì)胞為陽性凋亡細(xì)胞.每組隨機(jī)選取缺血側(cè)皮層6個(gè)視野，每組觀察6張切片，取平均數(shù)作為本組的代表數(shù)目.

2.5數(shù)據(jù)處理

3試驗(yàn)結(jié)果

3.1腦缺血再灌注造模大鼠神經(jīng)功能評分

腦缺血再灌注造模大鼠共計(jì)72只，其中1～3分者59只，符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，提示大鼠腦缺血再灌注造模成功，另有13只不符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，予以剔除，結(jié)果見表1.

3.2腦缺血再灌注造模大鼠死亡率統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)大鼠在手術(shù)中呼吸、體溫維持在正常生理范圍，手術(shù)視野無明顯活動性出血.術(shù)后大鼠死亡主要集中在1～3 d，3～7 d后死亡只數(shù)明顯減少，7～14 d大鼠全身狀況好轉(zhuǎn)無死亡或有較少死亡；模型組大鼠死亡率較假手術(shù)組高(P<0.05)；各藥物組大鼠死亡率較模型組比較有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2).

表1　腦缺血再灌注造模大鼠神經(jīng)功能缺損

表2　各組大鼠死亡率統(tǒng)計(jì)比較

3.3黃芪多糖對各組大鼠腦組織Caspase-3表達(dá)的影響

各組大鼠腦組織Caspase-3均有表達(dá)，多見于細(xì)胞漿內(nèi)；假手術(shù)組大鼠組織Caspase-3表達(dá)較弱，模型組較假手術(shù)組明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，各藥物組大鼠的Caspase-3表達(dá)均有減少(P<0.05)；以黃芪高劑量組尤為明顯(P<0.05)(圖1).

3.4黃芪多糖對各組大鼠腦組織形態(tài)的影響

HE染色光鏡觀察結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞間質(zhì)未見明顯水腫，神經(jīng)元細(xì)胞包膜光滑，胞漿豐富，胞核清晰可見，神經(jīng)纖維走行一致、排列整齊(圖2A)；模型組大鼠可見神經(jīng)元大片消失，間質(zhì)疏松，殘余細(xì)胞胞核固縮，染色質(zhì)凝聚(圖2B).各黃芪多糖給藥組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度較模型組輕，細(xì)胞間質(zhì)未見明顯水腫，神經(jīng)纖維走行可見(圖2C).

表3　各組大鼠腦組織Caspase-3陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

#表示與假手術(shù)組比較P<0.05；*表示與模型組比較P<0.05.

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：陽性對照組；D：黃芪多糖高劑量組；E：黃芪多糖中劑量組；F：黃芪多糖低劑量組； ×400.

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：黃芪多糖高劑量組；HE (×100).

4討論

細(xì)胞凋亡一直是分子生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).近幾年，隨著人們對腦缺血-再灌注后損傷保護(hù)機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)腦缺血-再灌注后“半暗帶”細(xì)胞的死亡以凋亡為主.目前研究表明觸發(fā)凋亡主要途徑是通過半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶級聯(lián)反應(yīng).半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶又稱為caspases，與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系，Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡中的最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，caspases介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的所有途徑最終都是通過激活Caspase-3 而完成的，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用[6].正常的腦神經(jīng)元中只有極少量Caspase-3蛋白表達(dá)，腦缺血-再灌注損傷可上調(diào)Caspase-3前體表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)Caspase-3前體去磷酸化，激活Caspase-3活性，最終引起腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[7].因此Caspase-3可被作為細(xì)胞凋亡的早期判斷指標(biāo)之一.研究有效藥物干預(yù)Caspase-3表達(dá)，可促進(jìn)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元損傷的修復(fù)與再生.中藥具有價(jià)格低、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、毒副反應(yīng)相對較小的特點(diǎn)和優(yōu)勢，在治療缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用方面已積累了豐富的經(jīng)驗(yàn).已有研究表明[8]黃芪多糖對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元具有保護(hù)作用，能明顯減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量.黃芪多糖是傳統(tǒng)中藥黃芪的主要有效成分，在調(diào)節(jié)免疫、炎癥、保護(hù)心血管、抗腫瘤等方面發(fā)揮著多種功能[9].

在本試驗(yàn)中，HE染色鏡下大鼠腦缺血-再灌注模型組可見神經(jīng)元細(xì)胞大片消失，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚，可見凋亡小體，提示造模成功；我們用免疫組化法觀察腦缺血再灌注后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡蛋白酶Caspase-3在胞漿中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組可見少量表達(dá)，模型組、各試驗(yàn)藥物組Caspase-3表達(dá)均高于假手術(shù)組，進(jìn)一步提示了Caspase-3的上調(diào)參與了腦缺血再灌注損傷[10].而黃芪多糖可降低Caspase-3的含量，減輕神經(jīng)元凋亡的程度，在試驗(yàn)組中尤以黃芪高劑量組效果明顯；因此，黃芪多糖能顯著抑制腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其作用可能是通過降低Caspase-3的活性實(shí)現(xiàn)的，且作用效果具有劑量依賴性.

黃芪多糖的很多作用仍有許多分子調(diào)節(jié)機(jī)制還未能完全闡明，還需要更多的研究證實(shí)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，黃芪多糖對缺血再灌注損傷機(jī)制的新靶點(diǎn)會有進(jìn)一步深入的研究，在抗細(xì)胞凋亡方面具有廣闊的應(yīng)用前景.

參考文獻(xiàn)

[1]武亞輝，衛(wèi)建平， 李光來，等.烏司他丁對大鼠腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)Bcl-2 Fas Caspase-3表達(dá)的影響[J].中國藥物與臨床，2012，12(2)：173-175

[2]李金田，魏舒暢，劉永琦，等.黃芪多糖對肺纖維化大鼠肺上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及自由基代謝的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(10)：2360-2362

[3]岳輝.黃芪多糖藥理作用的研究進(jìn)展[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32(1)：60-62

[4]Longa E Z,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20(1):84-91

[5]李惠.缺血性腦血管疾病[M].北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社,2002：47-57

[6]Denes L,Szilagyi G,Gal A,et al.Talampanel a non-competitive AMPA-antagonist attenuates caspase-3 dependent apoptosis in mouse brain after transient focal cerebral ischemia[J].Brain Res Bull,2006,70:260-262

[7]劉天會，陳瑞，杜艷玲.小鼠短暫前腦缺血海馬中半胱天冬酶-3酶原表達(dá)的變化[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2006,22(1)：55-58

[8]鄭一，高玉紅.Oligo基因芯片分析黃芪多糖對腦缺血再灌注大鼠DNA的保護(hù)作用[J].山東中醫(yī)雜志，2013(8):579-582

[9]Li H，Deng C Q，Chen B Y，et al.Total saponins of Panax notoginseng modulate the expression of caspases and attenuate apoptosis in rats following focal cerebral ischemia-reperfusion[J].J Ethnopharmacol，2009，121(3)：412-418

[10]Rami A,Jansen S,Giesser I,et al.Post-ischemic activation of caspase-3 in the rat hippocampus:evidence of an axonal and dendritic localisation[J].Neurochem Int，2003,43(3)：211-223

[11]王敏，俞詩源，劉佳昕，等.X射線輻射對小鼠腎組織中乳酸脫氫酶、Na+-K+ATP酶活性及Caspase-3蛋白、Bax蛋白表達(dá)的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014，49(2):41-48

(責(zé)任編輯趙曉倩)

收稿日期：2015-03-03；修回日期：2015-04-09

基金項(xiàng)目：甘肅省教育廳第二批科研項(xiàng)目(1006B-08)；甘肅中醫(yī)學(xué)院校內(nèi)中青年基金(BH2010-076).

通信作者：馬興銘，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事免疫學(xué)及中藥研究工作.E-mail:whammer@126.com

中圖分類號：S 852.16+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)03-0049-05