14C-尿素呼氣試驗(yàn)假陰性原因探討

高峰1*李文曉1,2

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院消化科1(830001)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院2

*Email: xjgf@sina.com

14C-尿素呼氣試驗(yàn)(14C-urea breath test,14C-UBT)作為一種敏感性、特異性高且安全可靠的非侵入性檢測方法，已廣泛應(yīng)用于幽門螺桿菌(Hp)感染的診斷。根據(jù)2012年“第四次全國幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告”中Hp感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)，UBT結(jié)果陽性即可診斷Hp現(xiàn)癥感染[1]，然而假陰性結(jié)果的存在將影響診斷準(zhǔn)確性，進(jìn)而影響疾病的治療。本研究對(duì)82例14C-UBT結(jié)果為假陰性患者的臨床資料行單因素和多因素分析，旨在探討14C-UBT結(jié)果出現(xiàn)假陰性的可能原因，以期提高Hp感染診斷的準(zhǔn)確性。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

納入2014年1月至2014年8月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院消化科明確14C-UBT結(jié)果為假陰性的患者82例，同期813例14C-UBT結(jié)果為真陽性的患者作為對(duì)照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：入組患者均行胃鏡活檢黏膜組織切片Warthin-Starry(W-S)銀染色、14C-UBT 和Hp糞便抗原(HpSA)檢測，W-S銀染色鏡檢觀察到Hp且HpSA檢測結(jié)果陽性者判定為Hp感染陽性并納入研究，其中14C-UBT結(jié)果陽性者判定為真陽性，進(jìn)入對(duì)照組，結(jié)果陰性者判定為假陰性，進(jìn)入病例組。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1個(gè)月內(nèi)使用過抑酸劑、鉍劑、抗菌藥物、益生菌以及胃復(fù)春等中藥制劑者；②近3個(gè)月內(nèi)參加過其他藥物研究臨床試驗(yàn)者；③不能配合完成各項(xiàng)Hp檢測者；④因14C-UBT有微量放射性，排除兒童和妊娠、哺乳期女性。

研究方案經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有入組患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1. 胃鏡檢查和活檢黏膜組織切片W-S銀染色：入組患者常規(guī)行胃鏡檢查，記錄食管、胃、十二指腸黏膜表現(xiàn)和主要病變。常規(guī)活檢部位為胃竇部大彎側(cè)和小彎側(cè)各1塊，如發(fā)現(xiàn)病灶，根據(jù)實(shí)際情況同時(shí)于病灶處取活檢行病理檢查。活檢組織4%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，W-S銀染色，由2名病理醫(yī)師分別進(jìn)行觀察，光學(xué)顯微鏡下觀察到Hp(黑色或褐色、大多呈弧形、兩端微彎的短桿狀菌)判定為Hp感染陽性，否則為Hp感染陰性。兩名病理醫(yī)師意見不一致時(shí)，由高年資第三方作最終判定。

2.14C-UBT：使用深圳市中核海得威生物科技有限公司提供的尿素[14C]呼氣試驗(yàn)藥盒(國藥準(zhǔn)字H20068129)。受檢者清晨空腹或禁食、禁水6 h以上后口服14C標(biāo)記的尿素膠囊，靜坐25 min后按藥盒說明書要求以集氣卡收集氣體樣品進(jìn)行液閃測定，檢測值≥100 dpm/mmol CO2判定為Hp感染陽性，否則為Hp感染陰性。

3. HpSA檢測：使用協(xié)和藥業(yè)有限公司提供的幽門螺桿菌抗原酶聯(lián)免疫法診斷試劑盒(國藥準(zhǔn)字S20010093)檢測HpSA，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。取受檢者留取的新鮮糞便樣品約100 mg，加入裝有400 μL樣品稀釋液(1∶4稀釋)的試管中振蕩 30 s，取100 μL加入包被Hp兔抗人多克隆抗體的微孔板，同時(shí)設(shè)空白孔和陽性、陰性對(duì)照孔。每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的Hp抗體輕搖混勻，室溫孵育1 h，洗滌6次后拍干，加入100 μL酶底物溶液輕搖15 s，室溫孵育15 min，加入100 μL終止液輕搖15 s，10 min 內(nèi)于酶標(biāo)儀波長450 nm處測定吸光度(A)值。檢測重復(fù)2次，結(jié)果取均值。A450 nm≥0.161判定為Hp感染陽性，<0.160 為Hp感染陰性。

4. Hp抗體分型：采用免疫印跡法檢測血清Hp特異性抗體并據(jù)此分型[2]。①Ⅰ型Hp：CagA和(或)VacA抗體陽性；②Ⅱ型Hp：尿素酶抗體陽性，CagA和VacA抗體陰性；③陰性Hp：CagA、VacA、尿素酶抗體均陰性。

5. 合并疾病的診斷：入組患者合并疾病的診斷系綜合臨床、內(nèi)鏡、活檢病理表現(xiàn)和相關(guān)檢查結(jié)果后作出，符合相關(guān)共識(shí)或臨床上通用的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、一般資料

病例組82例患者中男41例，女41例，年齡21~78歲，平均(46.49±12.03)歲；Ⅰ型Hp感染45例，Ⅱ型Hp感染31例，Hp分型抗體陰性6例；合并胃食管反流病(GERD)17例， 慢性非萎縮性胃炎(CNAG)66例，慢性萎縮性胃炎(CAG)10例，胃內(nèi)膽汁反流14例，胃潰瘍(GU)6例，胃息肉12例，胃癌4例，十二指腸炎4例，十二指腸潰瘍(DU)13例，十二指腸息肉3例，上消化道出血9例，胃大部切除術(shù)史9例。

對(duì)照組813例患者中男417例，女396例，年齡20~81歲，平均(44.37±16.29)歲；Ⅰ型Hp感染558例，Ⅱ型Hp感染210例，Hp分型抗體陰性45例；合并GERD 222例，CNAG 642例，CAG 142例，胃內(nèi)膽汁反流41例，GU 68例，胃息肉102例，胃癌9例，十二指腸炎60例，DU 189例，十二指腸息肉24例，上消化道出血24例，胃大部切除術(shù)史12例。

兩組間性別和年齡、民族構(gòu)成差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、14C-UBT假陰性結(jié)果可能影響因素的單因素分析

單因素分析顯示，Hp抗體分型、胃內(nèi)膽汁反流、胃癌、上消化道出血和胃大部切除術(shù)史在病例組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余納入分析的變量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。對(duì)于Hp抗體分型，進(jìn)一步的χ2分割顯示病例組與對(duì)照組間Ⅰ型和Ⅱ型Hp感染率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病例組Ⅱ型Hp感染率顯著高于對(duì)照組(P=0.013, <0.017)，因此Ⅱ型Hp感染進(jìn)入多因素分析。

表1　14C-UBT假陰性結(jié)果影響因素的單因素分析n(%)

三、14C-UBT假陰性結(jié)果可能影響因素的多因素分析

對(duì)單因素分析顯示P<0.1的變量行Logistic逐步回歸分析，結(jié)果顯示胃內(nèi)膽汁反流、胃大部切除術(shù)史、Ⅱ型Hp感染和上消化道出血為14C-UBT假陰性結(jié)果的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表2)。

討論

自1983年Marshall和Warren[3]首次報(bào)道從人胃黏膜活檢標(biāo)本中成功分離、培養(yǎng)出Hp以來，Hp感染及其相關(guān)疾病一直是消化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，現(xiàn)已明確Hp感染與慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤和胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，世界衛(wèi)生組織將Hp定義為Ⅰ類致癌原，因此Hp感染的檢測和診斷具有重要臨床意義。14C-UBT檢測Hp感染的原理為：Hp能產(chǎn)生、釋放大量尿素酶，將尿素分解為NH3和CO2；口服14C標(biāo)記的尿素后，如受檢者胃內(nèi)存在Hp，分解產(chǎn)生的14CO2在小腸上端吸收后進(jìn)入血液循環(huán)并隨呼氣呼出，因此通過分析呼氣中的14CO2含量即可判斷胃內(nèi)是否存在Hp。 UBT可反映全胃Hp感染狀況，克服了依賴于胃黏膜活檢的檢測方法因細(xì)菌灶性分布而造成的假陰性[1]，準(zhǔn)確性高且安全、無創(chuàng)、易于操作，是目前臨床上開展最為廣泛的Hp感染檢測方法，但仍有諸多因素可能影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。如國內(nèi)Hp感染處理共識(shí)報(bào)告指出，消化性潰瘍活動(dòng)性出血、嚴(yán)重CAG、胃惡性腫瘤可能導(dǎo)致尿素酶依賴性試驗(yàn)結(jié)果呈假陰性，胃大部切除術(shù)后患者采用UBT檢測Hp結(jié)果不可靠等[1]。然而，目前臨床上往往較重視藥物和飲食對(duì)14C-UBT結(jié)果的影響，而忽略了疾病自身因素的影響。本研究以14C-UBT結(jié)果為假陰性的患者為研究對(duì)象，對(duì)胃黏膜相關(guān)因素的影響進(jìn)行了探討。

表2　14C-UBT假陰性結(jié)果影響因素的多因素分析(Logistic逐步回歸分析)

胃黏膜組織切片W-S銀染色檢測Hp具有直觀性，鏡檢肉眼觀察到Hp，診斷Hp感染的可靠性高于14C-UBT；經(jīng)驗(yàn)證的單克隆抗體法HpSA檢測對(duì)診斷Hp感染亦有較高的敏感性和特異性[1]。為保證入組患者確為Hp感染者，本研究規(guī)定W-S銀染色和HpSA檢測均為陽性方可判定為Hp感染。結(jié)果在895例W-S銀染色和HpSA檢測均為陽性的患者中，82例(9.2%)14C-UBT結(jié)果為陰性(假陰性)，813例(90.8%)14C-UBT結(jié)果為陽性(真陽性)。單因素和多因素分析顯示，胃內(nèi)膽汁反流、胃大部切除術(shù)史、Ⅱ型Hp感染和上消化道出血為14C-UBT假陰性結(jié)果的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

上消化道出血導(dǎo)致14C-UBT結(jié)果假陰性的可能原因?yàn)椋篐p為微需氧菌，環(huán)境氧要求為5%~8%，在大氣環(huán)境和高氧環(huán)境中不能生長。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，環(huán)境pH值上升至4.0~5.0時(shí)，尿素酶活性進(jìn)行性降低[4]。消化道出血時(shí)，胃內(nèi)血液一方面可中和胃酸，提高胃內(nèi)pH值，另一方面可釋放大量氧氣抑制Hp生長，導(dǎo)致14C-UBT有較高的假陰性率。林勇等[4]的研究證實(shí)，在消化性潰瘍合并出血患者中，14C-UBT的假陰性率高達(dá)62.5%。李舜等[5]評(píng)估了14C-UBT在不同胃十二指腸黏膜病變中的診斷價(jià)值，亦發(fā)現(xiàn)其在合并上消化道出血者中假陰性率最高(38.7%)。

膽汁反流至胃腔可破壞胃黏膜屏障，使胃腔內(nèi)的H+逆向彌散至黏膜，破壞黏膜下環(huán)境，不利于Hp生長；同時(shí)膽酸對(duì)Hp具有強(qiáng)烈抑制作用，在高濃度膽汁酸的作用下，Hp外形濃縮成團(tuán)塊狀而失去活性[6]。Hp生長受抑導(dǎo)致胃內(nèi)Hp密度降低，可能造成胃內(nèi)膽汁反流患者14C-UBT假陰性率增高。

胃大部切除術(shù)后患者胃內(nèi)Hp密度降低，同時(shí)殘胃的排空速度加快[5,7]，使14C標(biāo)記的尿素在胃內(nèi)停留的時(shí)間變短，難以與胃黏膜充分接觸，從而影響呼氣中的14CO2含量，導(dǎo)致14C-UBT假陰性率增高。此外，胃大部切除術(shù)后胃空腸吻合(Billroth Ⅱ式)所致的胃內(nèi)膽汁反流以及殘胃胃酸缺乏、pH值升高，可能亦為14C-UBT假陰性率增高的原因之一。李曉波等[7]評(píng)估了各種常用Hp感染檢測方法在胃大部切除術(shù)后患者中的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)14C-UBT的特異性為100%，敏感性僅為63.6%，表明其不適用于此類患者Hp感染的診斷。李舜等[5]的研究中，14C-UBT 在胃大部切除術(shù)后患者中的假陰性率為27.3%，僅次于合并上消化道出血者。

除胃黏膜相關(guān)因素外，本研究發(fā)現(xiàn)14C-UBT假陰性結(jié)果的產(chǎn)生尚與所感染Hp菌株的類型有關(guān)，病例組Ⅱ型Hp感染率顯著高于對(duì)照組(37.8%對(duì)25.8%)，表明Ⅱ型Hp感染較Ⅰ型Hp感染更易導(dǎo)致14C-UBT假陰性結(jié)果。Ⅱ型Hp尿素酶陽性但不表達(dá)毒力因子CagA和VacA，菌株毒力較小，其易導(dǎo)致14C-UBT假陰性結(jié)果是否與菌株毒力有關(guān)，亦或尚有其他因素參與，有待進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，胃內(nèi)膽汁反流、上消化道出血、胃大部切除術(shù)史和Ⅱ型Hp感染是14C-UBT假陰性結(jié)果的可能影響因素。臨床上應(yīng)重視胃黏膜病變本身對(duì)14C-UBT結(jié)果的影響。對(duì)于有胃大部切除術(shù)史者以及合并胃內(nèi)膽汁反流、上消化道出血者，如14C-UBT結(jié)果為陰性，建議采取胃黏膜組織切片染色鏡檢、快速尿素酶試驗(yàn)、HpSA檢測等多種方法聯(lián)合檢測Hp，以提高診斷準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)

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(2014-11-05收稿；2014-11-23修回)

背景：14C-尿素呼氣試驗(yàn)(14C-UBT)敏感性、特異性高且為非侵入性，已廣泛應(yīng)用于幽門螺桿菌(Hp)感染的診斷，然而假陰性結(jié)果的存在將影響診斷準(zhǔn)確性。目的：探討14C-UBT結(jié)果出現(xiàn)假陰性的可能原因，以期提高診斷準(zhǔn)確性。方法：納入2014年1月至2014年8月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院明確14C-UBT結(jié)果為假陰性的患者82例，同期813例14C-UBT結(jié)果為真陽性的患者作為對(duì)照組。兩組患者均經(jīng)Warthin-Starry銀染色和Hp糞便抗原檢測判定為Hp感染陽性。以單因素和多因素分析篩選可能與14C-UBT假陰性結(jié)果相關(guān)的因素。結(jié)果：單因素分析中，共5個(gè)變量在病例組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)入多因素分析。Logistic逐步回歸分析顯示，胃內(nèi)膽汁反流(OR=3.961,P<0.001)、胃大部切除術(shù)史(OR=9.734,P<0.001)、Ⅱ型Hp感染(OR=1.892,P=0.012)和上消化道出血(OR=4.979,P<0.001)為14C-UBT假陰性結(jié)果的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論：胃內(nèi)膽汁反流、上消化道出血、胃大部切除術(shù)史和Ⅱ型Hp感染是14C-UBT假陰性結(jié)果的可能影響因素。對(duì)于有胃大部切除術(shù)史者以及合并胃內(nèi)膽汁反流、上消化道出血者，如14C-UBT結(jié)果為陰性，建議采取多種方法聯(lián)合檢測Hp。

關(guān)鍵詞14C-尿素呼氣試驗(yàn)；假陰性反應(yīng)；幽門螺桿菌；診斷

Investigation on Causes of False-negative14C-Urea Breath TestGAOFeng1,LIWenxiao1,2.1DepartmentofGastroenterology,thePeople’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi(830001);2ShiheziUniversitySchoolofMedicine,Shihezi,XinjiangUygurAutonomousRegion

Background:14C-urea breath test (14C-UBT) is widely used for diagnosis ofHelicobacterpylori(Hp) infection owing to its noninvasiveness and high sensitivity and specificity. Nevertheless, the presence of false-negative result can influence the diagnostic accuracy. Aims: To investigate the possible causes of false-negative14C-UBT for improving the accuracy of diagnosis. Methods: Eight-two cases with confirmed false-negative14C-UBT and 813 controls with true-positive14C-UBT at the People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region from Jan. 2014 to Aug. 2014 were enrolled. Patients in both groups were diagnosed as positive for Hp infection by Warthin-Starry silver staining combined with Hp stool antigen test. Univariate and multivariate analysis were performed to screen the factors related with false-negative14C-UBT. Results: In univariate analysis, 5 variables were significantly different between case group and control group (P<0.05), and were taken into the multivariate analysis. Logistic stepwise regression analysis revealed that bile reflux (OR=3.961,P<0.001), post subtotal gastrectomy (OR=9.734,P<0.001), type Ⅱ Hp infection (OR=1.892,P=0.012) and upper gastrointestinal bleeding (OR=4.979,P<0.001) were the independent risk factors for false-negative14C-UBT. Conclusions: Bile reflux, upper gastrointestinal bleeding, post subtotal gastrectomy and type Ⅱ Hp infection might be the influential factors for false-negative14C-UBT. Combined tests for Hp infection should be suggested in patients with negative14C-UBT who had undergone subtotal gastrectomy or complicated with bile reflux or upper gastrointestinal bleeding.

Key words14C-Urea Breath Test;False Negative Reaction;Helicobacter pylori;Diagnosis

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.03.006