陳嘉嶼 劉德科 吳紅梅 劉熙鈺 王彪猛 馬 強(qiáng) 許 英

蘭州軍區(qū)總醫(yī)院消化科1(730050) 體檢中心2 甘肅省中醫(yī)學(xué)校3

高原環(huán)境特征為低壓、低氧、高寒、高輻射、氣候多變［1］，高原缺氧引起的胃腸道功能紊亂臨床上主要表現(xiàn)為腹瀉、便秘、腹痛、腹脹、消化不良、惡心嘔吐、食欲減退等癥狀，甚至可出現(xiàn)嘔血、黑便和便血，并增加原有腸道炎癥性疾病的發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)［2-4］，嚴(yán)重影響急進(jìn)高原者的健康和生活。然而，目前對(duì)急進(jìn)高原者胃腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂的發(fā)生機(jī)制仍不明確，相關(guān)干預(yù)研究較少。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是參與調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其作用發(fā)揮系由相應(yīng)受體所介導(dǎo)，5-HT及其受體異常在胃腸道功能紊亂中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)中藥白術(shù)對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)具有雙向調(diào)節(jié)作用［5］，本研究以高原缺氧大鼠模型為研究對(duì)象，通過觀察其小腸推進(jìn)率、小腸組織病理學(xué)變化和5-HT4受體表達(dá)，探討高原缺氧對(duì)大鼠小腸運(yùn)動(dòng)的影響及其可能機(jī)制以及生白術(shù)的干預(yù)作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑、儀器

清潔級(jí) Wistar大鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào):SYXK(2012-0029)。中藥生白術(shù)(市售，產(chǎn)地浙江)，馬來酸曲美布汀膠囊(0.1 g/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040713，山西振東安特生物制藥有限公司)，5-HT4受體兔抗鼠多克隆抗體(Abcam plc.)，多聚HRP標(biāo)記抗兔IgG二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);FLYDWC50-ⅡC低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(貴州風(fēng)雷氧艙有限公司)，JD-801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

二、方法

1.動(dòng)物分組和造模:70只Wistar大鼠隨機(jī)分為7組，分別為對(duì)照組(蘭州海拔，1430 m)、3500 m海拔模型組和相應(yīng)海拔曲美布汀、生白術(shù)干預(yù)組、5000 m海拔模型組和相應(yīng)海拔曲美布汀、生白術(shù)干預(yù)組，每組10只。各組大鼠自由飲食，6組造模大鼠置于低壓低氧艙中，急進(jìn)速度0.3 m/s，直至達(dá)到設(shè)置的海拔高度，艙內(nèi)溫度22～25℃，造模時(shí)間3 d。造模過程中無大鼠死亡。

2.藥物干預(yù):曲美布汀組和生白術(shù)組分別予相應(yīng)藥物溶液1.35 g/L和540 g/L灌胃，每次2 mL，每日2次，共3 d。對(duì)照組和模型組予等體積0.9%NaCl溶液灌胃。

3.小腸推進(jìn)率測(cè)定:3 d后所有大鼠予2 mL墨汁灌胃，30 min后處死，測(cè)量小腸(幽門至回盲部)長(zhǎng)度和墨汁在小腸內(nèi)的推進(jìn)距離，小腸推進(jìn)率=墨汁推進(jìn)距離/小腸長(zhǎng)度×100%。

4.小腸組織病理學(xué)檢查:于距幽門2 cm處剪取長(zhǎng)度為1 cm的小腸組織，0.9%NaCl溶液洗凈，4%中性甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，橫斷面切片，片厚4 μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。小腸黏膜病理變化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):①炎性細(xì)胞浸潤(rùn):無或少量(正常)，0分;單視野下≤5%(輕度)，1分;5% ～20%(中度)，2分;＞20%(重度)，3分。②腺體減少:無腺體減少(正常)，0分;減少≤1/3(輕度)，1分;1/3～2/3(中度)，2分;＞2/3(重度)，3分。③黏膜表層壞死或脫落:無或少量(正常)，0分;損傷≤1/3(輕度)，1分;1/3～2/3(中度)，2分;＞2/3(重度)，3分?？偡譃?項(xiàng)評(píng)分之和的均值。

5.5-HT4受體免疫組化染色:小腸組織切片脫蠟、水化，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌，加入一抗5-HT4受體兔抗鼠多克隆抗體(1∶300)，37 ℃溫箱孵育90 min，PBS洗滌，依次加入試劑1和試劑2，37℃溫箱各孵育20 min，PBS洗滌，加入DAB顯色液，37℃溫箱孵育5 min，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。5-HT4受體陽性細(xì)胞呈棕色，分布于黏膜層和肌層。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)10×40倍視野，以形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算5-HT4受體免疫陽性面積，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、小腸推進(jìn)率

模擬海拔3500 m時(shí)，模型組大鼠小腸推進(jìn)率明顯減緩，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組小腸推進(jìn)率較模型組有所加快，但僅生白術(shù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與對(duì)照組相比無明顯差異(P ＞0.05)(表1)。

模擬海拔5000 m時(shí)，模型組大鼠小腸推進(jìn)率明顯加快，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組小腸推進(jìn)率較模型組有所減緩，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中曲美布汀組與對(duì)照組相比仍有顯著差異(P＜0.05)，生白術(shù)組與對(duì)照組相比則無明顯差異(P＞0.05)(表1)。

表1 各組大鼠小腸推進(jìn)率比較(，%)

表1 各組大鼠小腸推進(jìn)率比較(，%)

＊與對(duì)照組比較，P＜0.05;▲與同海拔模型組比較，P＜0.05;△與同海拔曲美布汀組比較，P＜0.05

二、小腸組織5-HT4受體表達(dá)

模擬海拔3500 m時(shí)，模型組大鼠小腸組織5-HT4受體免疫陽性面積明顯減少，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組5-HT4受體免疫陽性面積較模型組有所增加，但僅生白術(shù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與對(duì)照組相比無明顯差異(P＞0.05)(表2、圖1)。

模擬海拔5000 m時(shí)，模型組大鼠5-HT4受體免疫陽性面積明顯增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組5-HT4受體免疫陽性面積較模型組有所減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與對(duì)照組相比則均無明顯差異(P ＞0.05)(表2、圖1)。

表2 各組大鼠小腸組織5-HT4受體免疫陽性面積比較()

表2 各組大鼠小腸組織5-HT4受體免疫陽性面積比較()

＊與對(duì)照組比較，P＜0.05;▲與同海拔模型組比較，P＜0.05;△與同海拔曲美布汀組比較，P＜0.05

三、小腸組織病理學(xué)變化

模擬海拔3500 m時(shí)，模型組大鼠小腸黏膜中度損傷，病理評(píng)分與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組小腸黏膜損傷較模型組有所減輕，但僅生白術(shù)組病理評(píng)分與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與對(duì)照組相比無明顯差異(P＞0.05)(表3、圖2)。

模擬海拔5000 m時(shí)，模型組大鼠小腸黏膜重度損傷，病理評(píng)分與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);曲美布汀組和生白術(shù)組小腸黏膜損傷較模型組有所減輕，兩組病理評(píng)分與模型組和對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，生白術(shù)組與曲美布汀組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＜0.05)(表3、圖2)。

圖1 各組大鼠小腸組織5-HT4受體免疫組化染色(×400)

圖2 各組大鼠小腸組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)

表3 各組小腸黏膜損傷病理評(píng)分比較()

表3 各組小腸黏膜損傷病理評(píng)分比較()

＊與對(duì)照組比較，P＜0.05;▲與同海拔模型組比較，P＜0.05;△與同海拔曲美布汀組比較，P＜0.05

討 論

高原環(huán)境氣候惡劣，可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常，進(jìn)而影響胃腸道運(yùn)動(dòng)功能。急進(jìn)高原缺氧引起的胃腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂又稱胃腸型高原反應(yīng)，發(fā)病率較高，患者胃腸道運(yùn)功功能的改變因海拔高度不同而異，臨床表現(xiàn)多樣，海拔3500 m時(shí)，腸道運(yùn)動(dòng)呈抑制狀態(tài)，蠕動(dòng)緩慢;海拔高達(dá)5000 m時(shí)，腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂，蠕動(dòng)加快。上述變化的發(fā)生機(jī)制可能與機(jī)體反應(yīng)能力有關(guān)，3000 m海拔為機(jī)體反應(yīng)的臨界高度，隨著海拔的增高，空氣含氧量逐漸降低，機(jī)體通過神經(jīng)體液調(diào)節(jié)以滿足重要臟器的血氧供應(yīng)，導(dǎo)致腸道血氧供給減少，腸蠕動(dòng)減慢;海拔高達(dá)5000 m時(shí)，空氣含氧量進(jìn)一步降低，機(jī)體無法完成自我調(diào)節(jié)以滿足組織細(xì)胞的基本需求，導(dǎo)致各組織器官功能紊亂，腸蠕動(dòng)加快。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠在模擬海拔3500 m時(shí)表現(xiàn)為小腸推進(jìn)率減緩，在模擬海拔5000 m時(shí)表現(xiàn)為小腸推進(jìn)率加快，與上述理論相符，證實(shí)高原缺氧引起的小腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂與海拔高度密切相關(guān)。

5-HT主要由胃腸道黏膜層的腸嗜鉻細(xì)胞合成、分泌，參與胃腸道運(yùn)動(dòng)、分泌和感覺功能的調(diào)節(jié)以及腦-腸軸的調(diào)控，研究顯示5-HT可通過5-HT4受體調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)反射和平滑肌張力，從而發(fā)揮促動(dòng)力作用［6-9］。5-HT4受體廣泛分布于人類胃腸道黏膜層、黏膜下層和肌層，神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞中均可檢測(cè)到5-HT4mRNA表達(dá)［9］。5-HT激動(dòng)腸肌叢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上的5-HT4受體可引起平滑肌收縮，張力增加，使腸蠕動(dòng)加快;激動(dòng)平滑肌細(xì)胞上的5-HT4受體則可導(dǎo)致平滑肌舒張;腸上皮細(xì)胞中的5-HT4受體則主要參與腸道分泌功能的調(diào)節(jié)［10-12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在模擬的高海拔缺氧環(huán)境中，模型組大鼠小腸黏膜損傷明顯，黏膜表層中至重度壞死脫落，腺體減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，海拔越高，黏膜損傷越重;小腸組織中5-HT4受體的變化與小腸運(yùn)動(dòng)功能的變化相一致，3500 m較高海拔時(shí)，5-HT4受體數(shù)量減少，小腸推進(jìn)率減緩，5000 m高海拔時(shí)，5-HT4受體數(shù)量增加，小腸推進(jìn)率加快。推測(cè)小腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂與小腸組織缺氧損傷，使5-HT4受體表達(dá)分布異常有關(guān)。

根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，高海拔環(huán)境下機(jī)體缺氧可致脾胃氣虛無力，運(yùn)化功能失常。中藥白術(shù)為菊科植物白術(shù)的干燥根莖，性溫，味甘、苦，歸脾、胃經(jīng)，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功效，可用于脾虛食少、腹脹泄瀉等癥的治療。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)對(duì)胃腸道平滑肌具有興奮和抑制的雙向調(diào)節(jié)作用［5］，既可治療脾虛泄瀉，又可治療氣虛便秘。張印等［13］發(fā)現(xiàn)大劑量生白術(shù)能明顯促進(jìn)小鼠小腸推進(jìn)功能;趙文龍等［14］發(fā)現(xiàn)生白術(shù)能升高脾虛模型大鼠的血清胃泌素和生長(zhǎng)抑素水平，緩解脾虛癥表現(xiàn)出的便溏、納呆、少動(dòng)等表征;吳翰桂等［15］的研究顯示白術(shù)可增強(qiáng)小鼠小腸平滑肌收縮幅度和頻率，并改善其抗缺氧能力，對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)有明顯促進(jìn)作用。由此推測(cè)生白術(shù)可能對(duì)缺氧所致脾胃氣虛引發(fā)的胃腸道癥狀有一定改善作用。本實(shí)驗(yàn)以生白術(shù)干預(yù)高原缺氧模型大鼠，結(jié)果顯示其對(duì)模型大鼠3500 m較高海拔時(shí)的腸蠕動(dòng)減緩和5000 m高海拔時(shí)的腸蠕動(dòng)加快均有明顯改善作用，效果優(yōu)于陽性對(duì)照藥物馬來酸曲美布汀，同時(shí)小腸組織5-HT4受體數(shù)量發(fā)生相應(yīng)變化，小腸黏膜損傷明顯減輕，提示生白術(shù)可能通過調(diào)節(jié)5-HT4受體有效改善高海拔缺氧環(huán)境下的小腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂，對(duì)小腸黏膜損傷亦有一定修復(fù)作用。

綜上所述，急進(jìn)高原缺氧引起的胃腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂與海拔高度關(guān)系密切，臨床表現(xiàn)各異，不論是預(yù)防還是治療都應(yīng)區(qū)別對(duì)待。生白術(shù)作為治療胃腸道疾病的常用中藥，可能通過提高機(jī)體免疫、調(diào)節(jié)胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)等多個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)胃腸道功能的調(diào)控。本研究結(jié)果為生白術(shù)用于胃腸型高原反應(yīng)的防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其對(duì)5-HT4受體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 León-Velarde F，Maggiorini M，Reeves JT，et al.Consensus statement on chronic and subacute high altitude diseases［J］.High Alt Med Biol，2005，6(2):147-157.

2 周波，周其全.高原胃腸應(yīng)激綜合征［J］.西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2006，27(4):293-295.

3 李素芝，鄭必海，閆春城，等.急進(jìn)高原個(gè)體胃腸型高原反應(yīng)發(fā)生情況及其原因［J］.職業(yè)與健康，2011，27(4):427-429.

4 Vavricka SR，Rogler G，Maetzler S，et al.High altitude journeys and flights are associated with an increased risk of flares in inflammatory bowel disease patients［J］.J Crohns Colitis，2014，8(3):191-199.

5 陳文，何鴿飛，姜曼花，等.近10年白術(shù)的研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(2):338-340.

6 Tonini M，Pace F.Drugs acting on serotonin receptors for the treatment of functional GI disorders［J］.Dig Dis，2006，24(1-2):59-69.

7 Baker DE.Rationale for using serotonergic agents to treat irritable bowel syndrome［J］.Am J Health Syst Pharm，2005，62(7):700-711;quiz 712-713.

8 Gershon MD.Review article:serotonin receptors and transporters--roles in normal and abnormal gastrointestinal motility［J］.Aliment Pharmacol Ther，2004，20 Suppl 7:3-14.

9 Mader R，Kocher T，Haier J，et al.Investigation of serotonin type 4 receptor expression in human and nonhuman primate gastrointestinalsamples［J］. EurJ Gastroenterol Hepatol，2006，18(9):945-950.

10 Grider JR，F(xiàn)oxx-Orenstein AE，Jin JG.5-Hydroxytryptamine4 receptor agonists initiate the peristaltic reflex in human，rat，and guinea pig intestine［J］.Gastroenterology，1998，115(2):370-380.

11 Leclere PG，Prins NH，Schuurkes JA，et al.5-HT4 receptors located on cholinergic nerves in human colon circular muscle［J］.Neurogastroenterol Motil，2005，17(3):366-375.

12 Cooke HJ.Neurotransmitters in neuronal reflexes regulating intestinal secretion［J］.Ann N Y Acad Sci，2000，915:77-80.

13 張印，曹科.不同劑量生白術(shù)對(duì)小鼠小腸推進(jìn)功能的影響［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2010，12(5):847.

14 趙文龍，楊彥華，賈天柱.白術(shù)生、制品對(duì)脾虛大鼠血清SS，GAS，CHE 的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(14):212-215.

15 吳翰桂，朱玲，馬勇軍.白術(shù)對(duì)小鼠胃腸道活動(dòng)的影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.江蘇中醫(yī)藥，2005，26(11):66-67.