5-氨基水楊酸對人結(jié)腸癌細胞株HT-29增殖、凋亡以及細胞周期的影響

鄧勇彬王承黨*

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科福建醫(yī)科大學(xué)消化系病研究室(350005)

背景：潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌(UcCRC)是潰瘍性結(jié)腸炎(UC)最嚴重的并發(fā)癥，5-氨基水楊酸(5-ASA)能降低UcCRC的發(fā)生風(fēng)險。目的：探討5-ASA對人結(jié)腸癌細胞株HT-29增殖、凋亡以及細胞周期的影響，明確5-ASA對UcCRC的抑制作用。方法：以不同濃度(0、10、20、30、40 mmol/L) 5-ASA作用于HT-29細胞，采用CCK-8法檢測細胞增殖情況；采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況；采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期；采用免疫組化法檢測細胞有絲分裂調(diào)節(jié)因子AuroraB、BubR1蛋白表達。結(jié)果：5-ASA 10、20、30、40 mmol/L組HT-29細胞增殖抑制率、凋亡率隨5-ASA濃度升高而升高(P<0.05)。5-ASA 30、40 mmol/L 組G0/G1期細胞比例顯著低于0、10、20 mmol/L組(P<0.05)；5-ASA 0、10、20、30 mmol/L組S期細胞比例均顯著低于40 mmol/L組(P<0.05)；5-ASA 30、40 mmol/L組G2/M期細胞比例顯著高于0、10、20 mmol/L組(P<0.05)。AuroraB、BubR1平均光密度(MOD)值隨5-ASA濃度升高而降低(P<0.05)。5-ASA濃度與細胞增殖抑制率、凋亡率呈正相關(guān)(P<0.05)，與AuroraB、BubR1 MOD值呈負相關(guān)(P<0.05)。AuroraB、BubR1 MOD值與細胞增殖抑制率、凋亡率、G2/M期細胞比例呈負相關(guān)(P<0.05)，與G0/G1期細胞比例呈正相關(guān)(P<0.05)。AuroraB與BubR1 MOD值呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：5-ASA可抑制HT-29細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機制可能與5-ASA抑制AuroraB、BubR1表達，繼而影響細胞周期有關(guān)。

關(guān)鍵詞氨水楊酸；結(jié)直腸腫瘤；細胞增殖；細胞凋亡；細胞周期；AuroraB蛋白；BubR1蛋白；HT-29細胞株

AuroraB Protein;BubR1 Protein;HT-29 Cell Line

潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌(UcCRC)是潰瘍性結(jié)腸炎(UC)最嚴重的并發(fā)癥，UC患者并發(fā)結(jié)直腸癌的風(fēng)險較一般人群顯著增加，且與UC病程、病變范圍、疾病活動度相關(guān)[1]。UcCRC的發(fā)生機制尚未完全明確，研究認為可能與全染色體不穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)染色體不穩(wěn)定性、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、CpG島甲基化有關(guān)[2]，其中全染色體不穩(wěn)定性表現(xiàn)為細胞異常有絲分裂，非整倍體細胞增加，導(dǎo)致部分抑癌基因雜合性缺失。5-氨基水楊酸(5-ASA)是臨床上治療UC的一線藥物，其不僅具有良好的抗炎效果，還可通過多種途徑降低UcCRC的發(fā)生風(fēng)險，其機制可能與對細胞周期的干擾有關(guān)。絲/蘇氨酸蛋白激酶AuroraB和有絲分裂檢查點蛋白BubR1是細胞有絲分裂的重要調(diào)節(jié)因子，參與細胞周期調(diào)節(jié)。本研究通過探討5-ASA對人結(jié)腸癌細胞株HT-29增殖、凋亡以及細胞周期的影響，旨在明確5-ASA對UcCRC的抑制作用。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人結(jié)腸癌細胞株HT-29購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫。5-ASA(純度98%)(日本東京化成工業(yè)株式會社)，CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(德國羅氏診斷上海有限公司)，細胞周期檢測試劑盒(美國Becton Dickinson公司)，AuroraB兔抗人多克隆抗體、BubR1兔抗人多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

二、方法

1. 細胞培養(yǎng)：HT-29細胞以含1%青霉素-鏈霉素混合液、10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，常規(guī)消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2. CCK-8法檢測細胞增殖情況：取對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液，以1×104/孔接種于96孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，分別加入終濃度為0、10、20、30、40 mmol/L的5-ASA溶液，每組設(shè)5個復(fù)孔，避光孵育24 h后棄培養(yǎng)基，加入含10 μg/L CCK-8的培養(yǎng)基避光孵育1.5 h。以酶標儀測定450 nm波長處各孔吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=[1-(對照組A值-處理組A值)/(對照組A值-本底A值)]×100%。

3. TUNEL法檢測細胞凋亡情況：取對數(shù)生長期細胞，以1×105/皿接種于直徑3 cm的培養(yǎng)皿，孵育 24 h后，分別加入終濃度為0、10、20、30、40 mmol/L的5-ASA溶液，避光孵育24 h后加入4%多聚甲醛溶液固定60 min，3% H2O2甲醇溶液阻斷 10 min，0.5% Triton X-100溶液通透15 min，滴加TUNEL工作液孵育80 min，二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陽性細胞為細胞核呈棕黑色顆粒的皺縮細胞，光學(xué)顯微鏡下隨機選取3個視野(×400)計數(shù)陽性細胞，計算凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)，AI=(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

4. 流式細胞術(shù)檢測細胞周期：取對數(shù)生長期細胞，以8×105/孔接種于6孔板，孵育24 h后，換用含3%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h(血清饑餓法)以調(diào)整細胞周期，分別加入終濃度為0、10、20、30、40 mmol/L 的5-ASA溶液，避光孵育24 h后消化為單細胞懸液，加入A液固定10 min后加入B液(RNase A酶溶液)處理10 min，最后加入C液(PI)染色 30 min 后上機檢測。

5. 免疫組化法檢測AuroraB、BubR1蛋白表達：取對數(shù)生長期細胞，以1×105/皿接種于直徑3 cm的培養(yǎng)皿，孵育24 h后，分別加入終濃度為0、10、20、30、40 mmol/L的5-ASA溶液，避光孵育24 h后加入4%多聚甲醛溶液固定60 min，3% H2O2甲醇溶液 阻斷10 min，0.5% Triton X-100溶液通透(AuroraB，20 min； BubR1，10 min)，山羊血清封閉25 min，加入AuroraB兔抗人多克隆抗體(1∶200)孵育90 min、BubR1兔抗人多克隆抗體(1∶300)孵育60 min，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。光學(xué)顯微鏡下隨機選取3個視野(×200)，測定各組平均光密度(MOD)值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

一、5-ASA對HT-29細胞增殖的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，5-ASA 10、20、30、40 mmol/L 組HT-29細胞增殖抑制率分別為(8.20±3.03)%、(14.03±2.41)%、(21.05±3.33)%和(25.59±3.90)%，隨5-ASA濃度升高而升高，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

二、5-ASA對HT-29細胞凋亡的影響

TUNEL法檢測結(jié)果顯示，5-ASA 0、10、20、30、40 mmol/L組HT-29細胞的AI分別為(0.27±0.38)%、(7.11±1.65)%、(7.87±1.28)%、(10.63±2.31)%和(14.82±2.93)%，隨5-ASA濃度升高而升高，除10 mmol/L組與20 mmol/L組間外，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

三、5-ASA對HT-29細胞周期的影響

流式細胞檢測顯示，5-ASA 0、10、20 mmol/L組間HT-29細胞G0/G1期細胞比例無明顯差異(P>0.05)，30、40 mmol/L組G0/G1期細胞比例顯著低于0、10、20 mmol/L組，且 40 mmol/L 組顯著低于30 mmol/L 組(P<0.05)(表1)，提示10~20 mmol/L 5-ASA對G0/G1期細胞比例無明顯影響，而30~40 mmol/L 5-ASA可使G0/G1期細胞比例顯著減少。

5-ASA 0、10、20、30 mmol/L組間S期細胞比例無明顯差異(P>0.05)，但四組S期細胞比例均顯著低于40 mmol/L組(P<0.05)(表1)，提示10~30 mmol/L 5-ASA對S期細胞比例無明顯影響，而40 mmol/L 5-ASA可使S期細胞比例顯著增加。

5-ASA 0、10、20 mmol/L組間G2/M期細胞比例無明顯差異(P>0.05)，30、40 mmol/L組G2/M期細胞比例顯著高于0、10、20 mmol/L組，且40 mmol/L 組顯著高于30 mmol/L組(P<0.05)(表1)，提示10~20 mmol/L 5-ASA對G2/M期細胞比例無明顯影響，而30~40 mmol/L 5-ASA可使G2/M期細胞比例顯著增加。

表1　不同5-ASA濃度下HT-29細胞周期分布情況

四、5-ASA對HT-29細胞AuroraB表達的影響

免疫組化法檢測結(jié)果顯示，AuroraB陽性染色主要表達于細胞核，呈深棕色顆粒，細胞質(zhì)和細胞膜則均無表達。5-ASA 0、10、20、30、40 mmol/L組AuroraB MOD值分別為0.78±0.03、0.55±0.03、0.53±0.04、0.47±0.03和0.36±0.02，隨5-ASA濃度升高而降低，除10 mmol/L組與20 mmol/L組間 外，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

五、5-ASA對HT-29細胞BubR1表達的影響

免疫組化法檢測結(jié)果顯示，BubR1陽性染色主要表達于細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，細胞核中有少量表達。5-ASA 0、10、20、30、40 mmol/L組BubR1 MOD值分別為0.31±0.01、0.26±0.02、0.26±0.01、0.24±0.02和0.22±0.01，隨5-ASA濃度升高而降低，10、20、30、40 mmol/L組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但均顯著低于0 mmol/L組(P<0.05)(圖3)。

六、5-ASA濃度與HT-29細胞增殖、凋亡以及AuroraB和BubR1蛋白表達的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析顯示，5-ASA濃度與HT-29細胞增殖抑制率(rs=0.91，P=0.00)、凋亡率(rs=0.89，P=0.00)呈正相關(guān)，與AuroraB MOD值(rs=-0.96，P=0.00)、BubR1 MOD值(rs=-0.86，P=0.00)呈負相關(guān)。

七、AuroraB、BubR1蛋白表達與HT-29細胞增殖、凋亡以及細胞周期的關(guān)系

A：5-ASA 0 mmol/L組；B：5-ASA 10 mmol/L組；C：5-ASA 20 mmol/L組；D：5-ASA 30 mmol/L組；E：5-ASA 40 mmol/L組

A：5-ASA 0 mmol/L組；B：5-ASA 10 mmol/L組；C：5-ASA 20 mmol/L組；D：5-ASA 30 mmol/L組；E：5-ASA 40 mmol/L組

A：5-ASA 0 mmol/L組；B：5-ASA 10 mmol/L組；C：5-ASA 20 mmol/L組；D：5-ASA 30 mmol/L組；E：5-ASA 40 mmol/L組

Pearson相關(guān)分析顯示，AuroraB、BubR1 MOD值與HT-29細胞增殖抑制率(r=-0.81，P=0.00；r=-0.70，P=0.00)、凋亡率(r=-0.93，P=0.00；r=-0.89，P=0.00)、G2/M期細胞比例(r=-0.76，P=0.00；r=-0.73，P=0.00)呈負相關(guān)，與G0/G1期細胞比例(r=0.75，P=0.00；r=0.74，P=0.00)呈正相關(guān)。AuroraB與BubR1 MOD值呈正相關(guān)(r=0.894，P=0.00)。

討論

5-ASA應(yīng)用于炎癥性腸病(IBD)的治療至今已30余年，其不僅能有效控制結(jié)腸黏膜炎癥，還能通過調(diào)控COX-2/PGE2、EGFR、NF-κB、Wnt/β-catenin信號通路、調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白表達、提高細胞復(fù)制的保真度等途徑實現(xiàn)對UC癌變的化學(xué)預(yù)防效應(yīng)[3]。

5-ASA是治療UC的基礎(chǔ)藥物，有口服和灌腸兩種劑型，二者在臨床上多聯(lián)合應(yīng)用。治療UC時，5-ASA劑量為2~4 g/d，當(dāng)5-ASA劑量>1.2 g/d時，可使UcCRC發(fā)生率降低[4]。5-ASA的結(jié)腸黏膜內(nèi)濃度為其有效治療濃度，而結(jié)腸腔內(nèi)藥物濃度可間接反映黏膜內(nèi)濃度。每日服用2 g 5-ASA的UC緩解期患者，結(jié)腸腔內(nèi)5-ASA濃度約為20 mmol/L[5]，其腸腔內(nèi)濃度除與口服劑量有關(guān)外，尚與劑型相關(guān)。故本研究選擇0、10、20、30、40 mmol/L 5-ASA，模擬UC患者口服5-ASA后的結(jié)腸腔內(nèi)藥物濃度，探討該濃度5-ASA作用下人結(jié)腸癌細胞株HT-29的增殖、凋亡情況、細胞周期以及絲/蘇氨酸蛋白激酶AuroraB、有絲分裂檢查點蛋白BubR1的表達情況。

本研究結(jié)果顯示，5-ASA在0~40 mmol/L范圍內(nèi)可濃度依賴性地抑制HT-29細胞增殖、促進細胞凋亡，推測可能與5-ASA通過增強磷酸化表皮生長因子受體靶磷酸酶(SH-PTP2)活性以介導(dǎo)EGFR脫磷酸化、阻斷EGFR信號通路、激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、引起有絲分裂阻滯、誘導(dǎo)caspase依賴性細胞凋亡等因素有關(guān)[6-8]。目前，研究對5-ASA引起細胞周期阻滯的階段尚存在爭議。Reinacher-Schick等[8]的研究顯示，5-ASA能濃度依賴性地調(diào)節(jié)細胞周期，使細胞周期阻滯于G2/M期。然而Stolfi等[9]的研究顯示，5-ASA通過降低細胞周期蛋白CDC25A表達抑制結(jié)直腸癌細胞由S期向G2期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致S期細胞積聚。本研究結(jié)果顯示，HT-29細胞經(jīng)較高濃度(≥30 mmol/L)5-ASA作用后，G0/G1期細胞數(shù)量減少、S期和G2/M期細胞數(shù)量增加，即出現(xiàn)S期和G2/M期阻滯，提示G1/S期轉(zhuǎn)換受阻、有絲分裂檢查點等細胞周期卡點跨越異常；經(jīng)10~20 mmol/L 5-ASA作用的HT-29細胞S期和G2/M期阻滯效應(yīng)不明顯，提示低濃度5-ASA對HT-29細胞的細胞周期幾乎無影響，其對細胞增殖的抑制和促凋亡作用可能系通過COX-2/PGE2通路等其他途徑完成。然而，本研究中5-ASA的作用時間僅為24 h，因此不排除低濃度長時間作用下細胞周期可進一步發(fā)生改變，后期需研究藥物濃度、作用時間雙重因素對HT-29細胞周期的影響。

AuroraB基因位于染色體17p13，其編碼產(chǎn)物AuroraB蛋白主要表達于細胞核，具有絲/蘇氨酸激酶活性，與著絲粒中心蛋白(INCENP)、borealin、survivin構(gòu)成染色體載體復(fù)合物，參與染色體-微管連接、微管張力感知、姐妹染色體分離以及細胞質(zhì)分裂等事件[10]。AuroraB的表達具有時間性和空間性，其出現(xiàn)于細胞周期S期，在有絲分裂中-晚期轉(zhuǎn)換前存在于姐妹染色體著絲粒上，在有絲分裂晚期和末期存在于紡錘體中央?yún)^(qū)[11]。Nguyen等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，上皮細胞中AuroraB高表達可促進四倍體產(chǎn)生增多，誘導(dǎo)上皮細胞腫瘤形成。Tuncel等[13]的研究顯示，結(jié)直腸癌組織中AuroraB表達升高，其表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Azzariti等[14]的研究顯示，AuroraB抑制劑可使結(jié)腸癌細胞染色體數(shù)目明顯增加，改變細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡，具有抗腫瘤效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，HT-29細胞的AuroraB蛋白表達水平呈5-ASA濃度依賴性降低，尤以30、40 mmol/L 5-ASA組為著，伴5-ASA濃度依賴性細胞增殖抑制、凋亡增加和G2/M期細胞周期阻滯，提示較高濃度的5-ASA可通過某種途徑降低AuroraB表達，干擾有絲分裂，從而發(fā)揮抗癌效應(yīng)。5-ASA預(yù)防UcCRC的進程中是否存在類似效應(yīng)，有待進一步研究。

BubR1蛋白由有絲分裂檢查點Mad基因家族Bub1b基因編碼，位于染色體15q14~21，由23個外顯子組成，啟動子區(qū)有眾多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。BubR1在正常結(jié)腸上皮中僅表達于細胞質(zhì)，但在結(jié)腸腺癌細胞中，除表達于細胞質(zhì)外，在細胞核中亦有所表達，參與形成微管-著絲粒連接、與Bub1、Bub3、Mad2等蛋白形成有絲分裂檢查點復(fù)合物、與p53相互作用參與修復(fù)細胞紡錘體損傷[15-16]。Wei等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，BubR1表達缺失可加速胚胎細胞有絲分裂中晚期轉(zhuǎn)換，使異倍體增加。Rao等[18]的研究顯示，BubR1表達缺失可促進結(jié)腸腫瘤發(fā)生。然而本研究中，HT-29細胞經(jīng)不同濃度5-ASA作用后，BubR1表達呈濃度依賴性降低，伴HT-29細胞增殖抑制、凋亡增加和G2/M期細胞周期阻滯。在人腫瘤細胞中，與其他有絲分裂檢查點蛋白一樣，BubR1出現(xiàn)基因突變的概率非常小，Tighe等[19]的研究顯示異倍體結(jié)腸癌細胞的有絲分裂檢查點無異常改變。Roschke等[20]認為，BubR1等組成的有絲分裂檢查點異常改變并非細胞癌變的起始因素，而是通過促進原癌基因和抑癌基因突變引起細胞癌變。本研究中，HT-29細胞經(jīng)5-ASA作用后阻滯于G2/M期，說明有絲分裂檢查點功能正常，BubR1表達降低并未弱化有絲分裂檢查點功能。本研究結(jié)果顯示HT-29細胞的BubR1與AuroraB表達水平呈正相關(guān)，考慮與BubR1、Mad2、Bub1、Cenp-E等有絲分裂檢查點蛋白募集至著絲粒需AuroraB活化有關(guān)，提示經(jīng)5-ASA作用后，HT-29細胞AuroraB表達降低，導(dǎo)致其對BubR1的活化、募集減少。此外，BubR1啟動子區(qū)含有Sp1、Nkx-2、CdxA、SRY、MyoD、Ik-2、HNF-3b、Staf、Oct-1、Nkx-2、v-Myb、AML-1a等諸多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，故不排除其他通路參與5-ASA對BubR1的表達抑制。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，5-ASA可以濃度依賴性的方式降低HT-29細胞的AuroraB和BubR1表達，伴G0/G1期細胞數(shù)量減少、G2/M期細胞數(shù)量增加、細胞增殖抑制、凋亡增加。由此可見，5-ASA可抑制HT-29細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機制可能與5-ASA抑制AuroraB、BubR1表達，繼而影響細胞周期有關(guān)，這可能是5-ASA抑制UcCRC發(fā)生的作用機制之一。

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(2014-08-01收稿；2014-10-02修回)

·論著·

Effect of 5-Aminosalicylic Acid on Cell Proliferation, Apoptosis and Cell Cycle in Human Colon Cancer Cell Line HT-29DENGYongbin,WANGChengdang.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity;InstituteofDigestiveDiseases,FujianMedicalUniversity,Fuzhou(350005)

Correspondence to: WANG Chengdang, Email: wangcdhl@sina.com

Background: Ulcerative colitis-associated colorectal cancer (UcCRC) is the most serious complication of ulcerative colitis (UC). 5-Aminosalicylic acid (5-ASA) could reduce the risk of UC progressing to UcCRC. Aims: To investigate the effect of 5-ASA on cell proliferation, apoptosis and cell cycle in human colon cancer cell line HT-29 for verifying the inhibitory effect of 5-ASA on UcCRC. Methods: HT-29 cells were treated with different concentrations (0, 10, 20, 30, 40 mmol/L) of 5-ASA. Cell proliferation was measured by CCK-8 assay. Cell apoptosis was determined by TUNEL method. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. Expressions of cell mitotic regulators AuroraB and BubR1 were determined by immunohistochemistry. Results: Proliferation inhibition rates and apoptosis rates of HT-29 cells in 5-ASA 10, 20, 30, 40 mmol/L groups were increased with increase in concentration of 5-ASA (P<0.05). Proportions of cells in phase G0/G1 in 5-ASA 30, 40 mmol/L groups were significantly lower than those in 5-ASA 0, 10, 20 mmol/L groups (P<0.05); proportions of cells in phase S in 5-ASA 0, 10, 20, 30 mmol/L groups were significantly lower than that in 5-ASA 40 mmol/L group (P<0.05); while proportions of cells in phase G2/M in 5-ASA 30, 40 mmol/L groups were significantly higher than those in 5-ASA 0, 10, 20 mmol/L groups (P<0.05). Mean optical density (MOD) values of AuroraB and BubR1 were decreased with increase in concentration of 5-ASA (P<0.05). Concentration of 5-ASA was positively correlated with proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HT-29 cells (P<0.05), but was negatively correlated with MOD values of AuroraB and BubR1 (P<0.05). MOD values of AuroraB and BubR1 were negatively correlated with proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HT-29 cells as well as proportion of cells in phase G2/M (P<0.05), but were positively correlated with proportion of cells in phase G0/G1 (P<0.05). MOD value of AuroraB was positively correlated with MOD value of BubR1 (P<0.05). Conclusions: 5-ASA can inhibit proliferation and induce apoptosis in HT-29 cells, the mechanism may be related to inhibiting expressions of AuroraB and BubR1 and the resulted effect on cell cycle.

Key wordsMesalamine;Colorectal Neoplasms;Cell Proliferation;Apoptosis;Cell Cycle;

通信作者*本文，Email: wangcdhl@sina.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.03.002