王　松，　蔣忠軍，　包　錚，　胡　聶，　羅　平

半胱胺抑制催乳素依賴性腫瘤的機(jī)制

王松，蔣忠軍，包錚，胡聶，羅平

【摘要】目的通過半胱胺(Cysteamine，CS)對(duì)體外催乳素依賴性腫瘤細(xì)胞的影響與催乳素受體(prolactin receptor，PRLr)的相關(guān)性研究，來(lái)探討CS抑制催乳素依賴性腫瘤的機(jī)制。方法以人宮頸癌CasKi細(xì)胞株、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株、結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株為研究對(duì)象，MTT法檢測(cè)CS對(duì)細(xì)胞增殖的影響，Western Blot檢測(cè)CS對(duì)各細(xì)胞中PRLr的表達(dá)量影響，直線相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析CS的細(xì)胞增殖抑制率與PRLr表達(dá)量的關(guān)系。結(jié)果102mmol/L的CS細(xì)胞增殖抑制率最高，10-5mmol/L以下無(wú)增殖抑制作用，抑制效益呈劑量依賴性；CS對(duì)催乳素依賴性腫瘤細(xì)胞的抑制作用在24h時(shí)細(xì)胞抑制率最高，且對(duì)宮頸癌CasKi細(xì)胞株增殖抑制作用最大，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株次之，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株最低。PRLr在宮頸癌CasKi細(xì)胞株中表達(dá)量最高，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株次之，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株最低；CS抑制宮頸癌CasKi細(xì)胞株、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株增殖的效應(yīng)與抑制hPRLr的表達(dá)成負(fù)相關(guān)。結(jié)論低濃度CS能在體外抑制催乳素依賴性腫瘤宮頸癌CasKi細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，可能與降低細(xì)胞內(nèi)的PRLr表達(dá)水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】半胱胺；催乳素；催乳素受體；宮頸癌；乳腺癌；結(jié)腸癌；直線相關(guān)分析

Mechanisms of cysteamine inhibit prolactin-dependent tumorsWANGSong，JIANGZhongjun，BAOZheng，HUNie，LUOPing.(DepartmentofThyroidandBreastoncologicalsurgery,AffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421002,China)

Correspondingauthor:JIANGZhongjun,E-mail: 284065205@qq.com

Abstract：ObjectiveThis study was to investigate the relationship between the effects of CS and prolactin-dependent tumor cells in vitro and PRLr，so as to explore inhibition mechanism of CS on prolactin-dependent tumors. MethodsCervical cancer CasKi cells、breast cancer MDA-MB-231 cells and colon cancer SW480 cells were treated with different concentrations of CS，cell proliferation rate was detected by MTT assay，the expression of PRLr was detected by using Western blot，the relationship between cell proliferation rate and expression of PRLr was detected by linear correlation statistical analysis.Results102mmol/L CS had highest rate of cell proliferation，but 10-5mmol/L and lower had not，it showed a dose-dependent inhibition efficiency；the cell inhibition rates of CS in 24 h to prolactin-dependent tumor cells were the highest，largest on cervical cancer cell，followed on breast cancer，minimum on colon cancer，the same as the expression of PRLr. The cell proliferation inhibition of cervical cancer，breast cancer and the expression of PRLr had a negative correlation.ConclusionsThe low concentration CS could inhibit prolactin-dependent tumor cells on CasKi cervical cancer，breast cancer MDA-MB-231 cells in vitro，with the relevant of decreased levels intracellular expression of the PRLr.

Keywords：Cysteamine；prolactin；prolactin receptor；cervical cancer;breast cancer;colon cancer; Linear correlation analysis

半胱胺(Cysteamine,CS)是一種氨基硫醇類抗氧化劑，具有多種細(xì)胞活性，如對(duì)生長(zhǎng)抑素、催乳素、生長(zhǎng)激素、胰島素、甲狀腺激素等多種激素都產(chǎn)生影響，從而起到調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、緩解應(yīng)激等生理效應(yīng)[1-2]。研究表明，作為已知的化療增敏劑和輻射保護(hù)劑CS具有體外抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的作用[3]，但其具體抗腫瘤機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，催乳素(prolactin,PRL)有促進(jìn)宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞增殖的作用[4-6]，而CS是體內(nèi)的PRL抑制劑。因此，CS是否對(duì)宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌等激素依賴性腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，并且其抑制效果是否與PRL水平以及催乳素受體(prolactin receptor,PRLr)表達(dá)水平有關(guān)，目前尚不明確，也未見有CS對(duì)激素依賴性腫瘤細(xì)胞抑制效果以及機(jī)制的研究報(bào)道。本研究將從PRLr表達(dá)水平上來(lái)研究CS對(duì)激素依賴性腫瘤細(xì)胞的抑制作用，期待初步闡明相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源與主要試劑

人宮頸癌CasKi細(xì)胞購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室，人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞購(gòu)自上海市中科院細(xì)胞庫(kù)，上述細(xì)胞均保存在南華大學(xué)腫瘤研究所;抗人催乳素受體(anti-hPRLr,90kDa)半胱胺鹽酸鹽、抗β-actin(anti-β-actin,42 kDa) 購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)3種細(xì)胞均以含10%小牛血清和1×105IU/L青霉素及1×105IU/L鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，2～3 d傳代 1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT比色法實(shí)驗(yàn)分為9組?？瞻讓?duì)照組：加入細(xì)胞及培養(yǎng)基，用生理鹽水處理；CS組：濃度分別為102～10-5mmol/L 8個(gè)濃度組。MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率，取生長(zhǎng)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3種癌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，以0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至5×105個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，每組5個(gè)平行孔，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 24 h后，更換培養(yǎng)基，加入CS，之后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)結(jié)束前4 h于培養(yǎng)板中每孔加入5 g/L的MTT液20 μl，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。終止培養(yǎng)后，輕輕吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 150 μl，置于振蕩器上震蕩10 min，待紫藍(lán)色沉淀充分溶解，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞抑制率(細(xì)胞抑制率=1-用藥組A值/對(duì)照組A值×100%)。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PRLr蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為4組?？瞻讓?duì)照組：加入細(xì)胞及培養(yǎng)基，用生理鹽水處理；CS組：分別為10-4、10-2和100mmol/L 3個(gè)濃度組。取培養(yǎng)24 h處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率結(jié)果分析

CS對(duì)宮頸癌CasKi細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、結(jié)腸癌 SW480 細(xì)胞增殖的作用比較見表1。

由表1顯示，10-4～102mmol/L CS能抑制CasKi細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞增殖(P<0.05)，在10-4～101mmol/L CS之間抑制效應(yīng)具有濃度依賴性(P<0.05)，但在101～102mmol/L CS之間無(wú)濃度依賴性(P>0.05)；10-1～102mmol/L CS能抑制SW480細(xì)胞增殖，100～101mmol/L CS有濃度依賴性(P<0.05)，但10-4～10-2mmol/L CS沒有抑制效應(yīng)(P>0.05)，10-5mmol/L CS表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)。

2.2蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CS對(duì)3種腫瘤細(xì)胞系中PRLr表達(dá)差異的比較

圖1及表2顯示，在對(duì)照組中，CasKi、MDA-MB-231和SW480 細(xì)胞中PRLr表達(dá)的印跡區(qū)帶的灰度面積掃描值分析，3種腫瘤細(xì)胞系中PRLr表達(dá)差異顯著，以宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)量最高，乳腺癌細(xì)胞次之，結(jié)腸癌細(xì)胞最低(P<0.05)。圖2及表2示，100mmol/L、10-2mmol/L、10-4mmol/L CS對(duì)3種腫瘤細(xì)胞系中PRLr表達(dá)的印跡區(qū)帶的灰度面積掃描值分析，3種濃度CS對(duì)CasKi細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞中PRLr表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而對(duì)SW480 細(xì)胞中PRLr表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　CS對(duì)3種腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用的比較±s)

注：與對(duì)照組比較*P<0.05，相鄰組間比較#P<0.05。

圖1　hPRLr在3種腫瘤細(xì)胞中PRLr表達(dá)印跡區(qū)帶圖

圖2　CS對(duì)3種腫瘤細(xì)胞系PRLr表達(dá)印跡區(qū)帶圖比較

表2　蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CS對(duì)3種腫瘤細(xì)胞系中

注：與對(duì)照組比較*P<0.05，與對(duì)照組中CasKi細(xì)胞比較#P<0.05。

2.3CS的細(xì)胞抑制率與PRLr細(xì)胞表達(dá)量的相關(guān)性分析

圖3顯示，由spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CS的CasKi細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率與該藥處理前后細(xì)胞PRLr表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)(RCasKi=-0.928 6；RMDA-MB-231=-0.886 2，P<0.05)，而在SW480細(xì)胞無(wú)相關(guān)趨勢(shì)(RSW480<0.05；P>0.05)，說明一定濃度的CS是通過調(diào)節(jié)PRLr表達(dá)來(lái)抑制CasKi細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞增殖的。

圖3　CS的細(xì)胞抑制率與細(xì)胞中hPRLr表達(dá)量相關(guān)性分析比較圖

3討論

CS是細(xì)胞內(nèi)抗氧化物，能有效地保護(hù)正常細(xì)胞，減輕放化療的毒副作用，作為腫瘤放化療的輔助用藥已用于臨床，安全性已經(jīng)被證實(shí)。在體外實(shí)驗(yàn)中，CS本身或納米顆?；蚱渌曹椈衔锬芤种粕窠?jīng)源性腫瘤、乳腺癌、黑色素瘤等細(xì)胞的增殖，由此預(yù)見CS的抗腫瘤研究前景可觀[7-11]。

本研究結(jié)果表明，10-4～102mmol/L CS在體外抑制宮頸癌CasKi細(xì)胞與乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖，且在一定濃度范圍內(nèi)(10-4～101mmol/L)呈現(xiàn)濃度依賴性，這一結(jié)果與Dominy等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。但是針對(duì)CS對(duì)乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制率差異比較中發(fā)現(xiàn)CS在體外抑制宮頸癌、乳腺癌細(xì)胞系的效應(yīng)較結(jié)腸癌明顯。而有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌CasKi細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞有一共同特征，是能夠通過自分泌或者旁分泌PRL的細(xì)胞系，是PRL激素依賴性腫瘤[5]。而PRL具有促進(jìn)乳腺癌、宮頸癌等腫瘤增殖生長(zhǎng)的作用[12]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)低濃度(10-4～100mmol/L)的CS對(duì)宮頸癌、乳腺癌細(xì)胞增殖具有抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)該濃度的CS可以抑制宮頸癌、乳腺癌細(xì)胞系中PRLr表達(dá)，從而可以說明CS是通過抑制細(xì)胞中PRL/PRLr信號(hào)通路來(lái)抑制腫瘤增殖的。

本研究還發(fā)現(xiàn)高濃度(10-1～102mmol/L)CS抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖，而低濃度(10-5mmol/L)CS卻促進(jìn)細(xì)胞增殖。此雙重作用分析如下：高濃度CS抑制癌細(xì)胞增殖可能與CS的氧化性有關(guān)[2]，亦可能與腫瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶有關(guān)[13]，低濃度(10-5mmol/L)CS促進(jìn)癌細(xì)胞增殖作用可能與其抑制生長(zhǎng)抑素有關(guān)[14]。目前研究證實(shí)，生長(zhǎng)抑素及其類似物能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖，而CS是生長(zhǎng)抑素抑制劑，所以揣測(cè)CS是通過耗竭生長(zhǎng)抑素從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[14]，但是詳細(xì)機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。而Iishi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中CS抑制結(jié)腸癌腫瘤增殖的機(jī)制可能與降低組織去甲腎上腺素的水平有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)CS能在一定的低濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性地抑制宮頸癌、乳腺癌等催乳素依賴性癌細(xì)胞的增殖，且與PRLr表達(dá)水平有關(guān)，為CS治療癌癥患者提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為研究CS在PRL/PRLr信號(hào)通路中的作用做了鋪墊。由于本研究?jī)H為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，CS的臨床實(shí)用抗腫瘤作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)研究。

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論著

[收稿日期：2015-04-24][本文編輯：李筱蕾]

文章編號(hào)：1674-4136(2015)04-0205-04

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.04.001

通訊作者：蔣忠軍，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：乳腺甲狀腺疾病防治研究，E-mail: 284065205@qq.com

基金項(xiàng)目：作者單位： 421002湖南衡陽(yáng)，南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院甲乳腫瘤外科;第一作者： 王松，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：乳腺甲狀腺疾病防治研究，E-mail: wangmomo1983@sohu.com