★　吳丹　程擴榮　舒雄　(.江西省藥品審評中心　南昌 330046；.江西省金洹醫(yī)療器械股份有限公司　南昌330000)

一種快速檢測糞便中血紅蛋白的膠體金方法

★吳丹1程擴榮2舒雄2(1.江西省藥品審評中心南昌 330046；2.江西省金洹醫(yī)療器械股份有限公司南昌330000)

摘要：本文介紹了一種快速檢測糞便中血紅蛋白的方法的工藝過程及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上的分析性能研究。用免疫學(xué)方法檢測人糞便樣本中出現(xiàn)的人血紅蛋白，樣本中出現(xiàn)的血紅蛋白先與金標抗體形成抗原-金標抗體復(fù)合物，依靠毛細作用在纖維膜上層析，運行到檢測線時，遇到包被抗體形成抗體-抗原-金標抗體復(fù)合物，在檢測區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，結(jié)果為陽性。 這種膠體金方法具有優(yōu)良的特異性，可以有效的檢測出人體中的血紅蛋白，并且不會受到藥物與飲食方面的影響，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。

關(guān)鍵詞：標記技術(shù)；膠體金；便潛血；免疫層析

便隱血是指消化道出血量很少，肉眼無法觀察，并且紅細胞被消化分解，顯微鏡也無法觀察的一種臨床表現(xiàn)，對消化道出血診斷具有重要的臨床意義。免疫膠體金法是以膠體金作為標記物，利用抗原抗體特異性反應(yīng)，通過有顏色的膠體金顆粒放大免疫反應(yīng)的系統(tǒng)，讓結(jié)果直接在固相載體上顯現(xiàn)出來，主要是用于就檢測樣品中含有的抗原或抗體[1]。它利用抗人血紅蛋白與人血紅蛋白有高度特異性的特點檢測便隱血。不受動物的血、肉、含過氧化物酶的蔬菜水果、鐵劑、維生素C的影響，因此不需控制飲食。免疫膠體金法具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、靈敏度、精確度及制造過程中的可重復(fù)性特點[2-3]，在臨床各種疾病導(dǎo)致出血的診斷中都起到了準確的效果。

1材料

1.1主要藥品和耗材

名稱規(guī)格生產(chǎn)廠家碳酸鉀AR天津市光復(fù)精細化工研究所十二水合磷酸氫二鈉AR西隴化工股份有限公司二水合磷酸二氫鉀AR西隴化工股份有限公司三羥甲基氨基甲烷BR國藥集團化學(xué)試劑有限公司檸檬酸蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司蔗糖AR西隴化工股份有限公司牛血清白蛋白上海源生物科技有限公司酪蛋白BR上?？肆稚锟萍加邢薰就聹?20CP西隴化工股份有限公司檸檬酸三鈉BR國藥集團化學(xué)試劑有限公司氯金酸天津市化學(xué)試劑廠抗Hb單抗北京萬城科技有限公司鼠抗Hb抗體北京萬城科技有限公司羊抗屬IgG抗體北京萬城科技有限公司PVC板300*60mm上海生物科技有限公司硝酸纖維素膜25mm*50m上海生物科技有限公司聚酯纖維膜661325cm*30cm上海生物科技有限公司GF-08玻璃纖維膜20cm*30cm上海生物科技有限公司H-1吸水紙20cm*30cm上海生物科技有限公司

1.2儀器與設(shè)備DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器(金壇市科興儀器廠);FA1104B電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司);TG20KR-D高速冷凍離心機(長沙東旺實驗儀器有限公司);101-2電熱恒溫干燥箱(上海東星建材試驗設(shè)備有限公司);FGS510臺式劃膜噴金機(杭州峰航科技有限公司).

2方法與操作

2.1免疫膠體金的制備方法

2.1.1制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，具體方法如下：

量取100 mL工藝用水加入到平底燒瓶中，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，加入1%氯金酸溶液1.5mL，邊加熱邊攪拌至沸騰。沸騰10min后，量取4mL的1%檸檬酸三鈉溶液，迅速一次性加入到容器中，繼續(xù)加熱煮沸10min，停止加熱，室溫冷卻。冷卻后，將膠體金溶液補水至100mL，使用紫外分光光度計掃描鑒定，400～600nm的紫外掃描。來確定最大的吸收峰波長。制備的膠體金的最大吸收峰的波長為530nm。

2.1.2配制溶液

(1) 0.2 mol/L碳酸鉀溶液：在100 mL 蒸餾水中溶解2.76 g碳酸鉀，搖晃15 min，充分溶解。

(2) 0.01mol/l PB緩沖液：準確稱取2.5 g磷酸氫二鈉和0.49 g磷酸二氫鉀，溶于1000 mL蒸餾水中，充分溶解，測量所配溶液的pH值。

(3) 1%檸檬酸三鈉溶液：準確稱取1 g的檸檬酸三鈉于100 mL蒸餾水容器中。

(4) 1%氯金酸溶液：將1g的氯金酸固體充分溶解在100mL蒸餾水容器中。

(5) 10%酪蛋白：準確稱取1 g酪蛋白于10 mL蒸餾水容器中，37 ℃水浴加熱。

(6) 10%牛血清白蛋白：準確稱取1 g牛血白蛋白于10 mL蒸餾水容器中。

(7)FOB檢測線包被液：用微量槍準確量取9.3mg/mL的鼠抗人FOB抗體0.038 mL，加入到0.162 mL的0.01 MPB緩沖液中，充分混勻15 min，終體積0.2 mL。使鼠抗人FOB抗體的終濃度為3.0 mg/mL即用即配。

(8)FOB質(zhì)控線包被液：用微量槍準確量取12 mg/mL羊抗鼠IgG抗體0.034 mL，加入到0.166 mL的0.01MPB緩沖液中，充分混勻15min，終體積0.2mL。使羊抗鼠IgG抗體的終濃度為3.0 mg/mL即用即配。

(9) 膠體金結(jié)合物稀釋液：準確稱取1.2 g 三羥甲基氨基甲烷于80 mL蒸餾水容器中，加入適量的檸檬酸于容器中，調(diào)節(jié)pH值(在7.60±0.10范圍內(nèi))。準確稱取5.0 g蔗糖、0.3g牛血清白蛋白、0.35g酪蛋白于容器中，再準確量取5 mL吐溫-20加入到容器中，40 ℃水浴可全部溶解。用蒸餾水加到體積100 mL，溶液充分溶解。

2.2固相硝酸纖維素膜

2.2.1質(zhì)控線噴液量的選擇將羊抗屬IgG抗體稀釋到2mg/mL，使用自動劃膜噴金機噴涂質(zhì)控線，分別為1.4,1.2,1.0,0.8μL/cm，比較用不同噴涂量，得到劃線的效果。結(jié)果顯示1.0μL/cm噴涂量時，所劃線部分邊緣整齊，線條精細。

2.2.2硝酸纖維素膜檢測線與質(zhì)控線抗體的包被當(dāng)噴涂量為1.0μL/cm時，將抗Hb單抗稀釋至2mg/mL，質(zhì)控線羊抗屬IgG抗體稀釋到2mg/mL，分別包被硝酸纖維素膜的質(zhì)控線和檢測線。37℃干燥5h。

2.3膠體金-抗體結(jié)合條件的選擇

2.3.1鼠抗FOB單抗與膠體金結(jié)合取10個10mL 小燒杯，每個加入2mL的膠體金溶液，加入4μL鼠抗FOB單抗溶液，每個分別加入0.2M的碳酸鉀溶液0,2,4,6,8,10,12,14,16,18μL；測定pH值及觀察每個燒杯的膠體金的顏色。結(jié)果見表1。隨著碳酸鉀的量逐漸增加，膠體金的顏色變得更深，pH值不斷增大。但是6號管中pH和顏色度符合要求，確定1mL 加入5μL的碳酸鉀溶液。

2.3.2膠體金結(jié)合物制備分別取1mL的離心管3個，加入1mL的膠體金溶液，按照比例加入0.2M的碳酸鉀溶液5μL，混勻，靜置10min；按照每毫升加入2μL的比例加入鼠抗FOB單抗，混勻，靜置30min；分別按照1%的比例加入膠體金穩(wěn)定劑10μL，混勻，靜置10min；4℃ 10000r/min離心10,15,20min，觀察上清液的渾濁程度。結(jié)果顯示離心15min效果最好。

2.4操作

2.4.1預(yù)檢將離心后的膠體金結(jié)合物稀釋至0.6倍，稀釋后的溶液按照3mL浸泡100cm2試紙條，37℃干燥3～5h，裁條寬度為1cm，裁好的試紙條與樣本墊、硝酸纖維素膜等材料依次粘貼，切條后使用人血紅蛋白純品檢測。結(jié)果劍表2。結(jié)果顯示檢測陽性質(zhì)控品1～5均為陽性，檢測陰性參考品為陰性結(jié)果。

表1　不同碳酸鉀溶液量的實驗結(jié)果

表2　預(yù)檢結(jié)果

2.4.2金標反應(yīng)膜的制備

表3　金標反應(yīng)膜組成

注：(1)抗FOB單抗的包裝規(guī)格會有不同，但是100板的總量都是1.5 mg ；(2)此規(guī)格每張的有效長度以20 cm計，每板的寬度為1 cm。

2.4.3膠體金溶液的制備量取180 mL工藝用水加入到平底燒瓶中，加入1%氯金酸溶液5mL，邊加熱邊攪拌至沸騰。沸騰5min后，量取8mL的1%檸檬酸三鈉溶液，迅速一次性加入到容器中，繼續(xù)加熱煮沸5min，停止加熱，室溫冷卻。冷卻后，將膠體金溶液補水至100mL。

2.4.4膠體金-抗體結(jié)合物制備加入150mL的膠體金溶液，按照比例加入0.2M的碳酸鉀溶液0.75mL，混勻，靜置10min；按照每毫升加入4μL的比例加入鼠抗FOB單抗0.5mL，混勻，靜置30min；按1%的比例加入膠體金穩(wěn)定劑1.5mL，混勻，靜置20min；4℃ 15000r/min離心20min，收集沉淀。

2.4.5金標反應(yīng)膜制備(100板)加膠體金結(jié)合物稀釋液90mL混勻，制得金標抗體溶液，將金標抗體溶液按照每100cm2聚酯纖維膜3mL均勻涂布，每張需要18mL金標抗體溶液，37℃干燥3～5h。

將晾干的金標反應(yīng)膜按照指定的寬度進行分切(一般是10±1mm)，記作金墊。用鋁箔袋密封，室溫下存放。

2.4.6硝酸纖維反應(yīng)膜的制備

2.4.6.1包被羊抗鼠IgG抗體(質(zhì)控線)、鼠抗Hb抗體(檢測線)使用0.01M的PB溶液分別稀釋至2mg/mL，分別加入到自動劃膜噴金機對應(yīng)的位置；將設(shè)備的噴涂量為1μL/cm，質(zhì)控線和檢測線的間隔為5mm即對應(yīng)的噴涂嘴相差5mm。包被后的硝酸纖維素膜，37℃干燥3～5h。

2.4.6.2分切將晾干的硝酸纖維素膜用鋁箔袋密封，記作硝酸纖維膜，室溫下存放。

表4　硝酸纖維反應(yīng)膜清單

注：(1)PVC板沿板上的虛線標志撕開；(2)將硝酸纖維膜對應(yīng)的貼在PVC板部分。

2.5試紙條

2.5.1試紙條的主要組成成分

表5　試紙條的主要組成成分

注：(1)PVC板沿板上的虛線標志撕開；(2)將硝酸纖維膜對應(yīng)的貼在PVC板部分。

2.5.2試紙條的組成、結(jié)構(gòu)及示意圖試紙條主要是油樣本墊、金標墊、包被膜、吸收墊及其PVC板組成。試紙條的示意圖見圖1。

圖1　膠體金法試紙條示意圖

3分析性能研究將組裝好的試紙條進行檢驗，分別進行陰性檢驗、最低檢測限、重復(fù)性、特異性及穩(wěn)定性檢驗。

3.1試紙條的陰性檢驗抽取10分試紙條，使用公司內(nèi)部的陰性參考品(主要是磷酸鹽緩沖液)分別加入100μL進行檢測，均為陰性。檢驗結(jié)果符合試紙條的要求。

3.2試紙條的最低檢測限檢驗取30份試紙條，用濃度為0.4,0.2,0.1 μg/mL的人血紅蛋白樣本液分別加入100μL進行檢測，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，在人血紅蛋白濃度值為0.2 μg/mL時，檢驗結(jié)果顯示的弱陽性，是符合試紙條檢驗要求。

表6　試紙條最低檢測線檢驗結(jié)果

3.3試紙條的重復(fù)性檢驗取10份試紙條，用2 μg/mL的血紅蛋白樣本液分別加入100μL進行檢測，檢驗結(jié)果顯示陽性，顏色的強度是均一的。符合試紙條的檢驗要求。

3.4試紙條的特異性檢驗取3份試紙條，使用500 μg/mL的豬血紅蛋白和牛血紅蛋白、2000 μg/mL辣根過氧化物酶分別加入100μL進行檢驗，結(jié)果顯示陰性，說明試紙條對豬、牛血紅蛋白和辣根過氧化物酶沒有特異性。

4展望

膠體金免疫法測定便隱血，方法簡單、快速、對人體無害，具有高的靈敏度與特異性，但是仍存在一些問題，如只能定性不能定量檢測；樣本放置一段時間對檢測的影響較大，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果上消化道出血量較大時，發(fā)生前帶現(xiàn)象而產(chǎn)生假陰性結(jié)果；檢測過程中發(fā)生假陽性現(xiàn)象。隨著不斷的研究和發(fā)展，膠體金法檢測便隱血也會得到不斷地完善，為科學(xué)、臨床方面開辟新的途徑。

參考文獻

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A Colloidal Gold Method Which can Rapidly Detect the Hemoglobin From Human Feces

WU Dan1, CHENG Kuo-rong2, SHU Xiong2

1.Drugapprovalcenterinjiangxiprovince,Nanchang330046,China

2.JiangxiJinhuanMedicalInstrumentCo.,LTD,Nanchang330046,China

Abstract:This paper introduced the process and the performance of a method which can rapidly detect the hemoglobin from the feces.The hemoglobin which was detected from the human feces by the immunological methods, with the gold mark antigen will form a new antigen -gold mark antibody complex which was chromatography on the fiber membrane by the action of the capillary. When it moved to the test line where met the coating antibody, antibodies-antigen-gold mark compounds began to emerges, then a red line which represented positive in the detection area will appear.The method of the colloidal gold has a good specificity that it can effectively detect the hemoglobin in the human feces ,avoiding the impact of the drugs and the dietary.So it plays a great significant role in the field of the medicine.

Key words:Labeling Technique;Colloidal Gold;Feces Occult Blood;Immune Chromatography

收稿日期：(2015-05-22)編輯：曾文雪

中圖分類號：R446.6

文獻標識碼：A