蒼 楓 陳光達(dá) 羨東堡 金宇保靈生物藥品有限公司 010030

牛病毒性腹瀉(BVD)又稱黏膜病(MD)，是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的以高熱、白細(xì)胞減少、沉郁、不食、下痢、大量流涎、減奶以至停奶、反芻停止、結(jié)膜炎和口腔黏膜充血出現(xiàn)潰瘍斑為特征的一種傳染病，懷孕?？赡馨l(fā)生流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒，新生犢牛經(jīng)常發(fā)生致死性腹瀉[1]。中空纖維膜超濾技術(shù)廣泛應(yīng)用于動物疫苗濃縮工藝中，選擇適宜孔徑的超濾膜能夠有效去除病毒收獲液中的雜蛋白成分，提高單位體積內(nèi)的病毒含量。本試驗分別采用截留分子量為300NMWC 和500NMWC的中空纖維超濾膜系統(tǒng)對BVDV 病毒進(jìn)行濃縮，并對兩種不同截留分子量中空纖維膜濃縮效果進(jìn)行了比較，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

（1）材料。MDBK 細(xì)胞由金宇保靈生物藥品有限公司國家獸用疫苗工程實驗室提供，BVDV NMG 株由中國獸藥監(jiān)察所提供。中空纖維超濾系統(tǒng)購自GE公司，型號為VERSAFLUX。中空纖維超濾柱購自GE公司，具體型號為UFP-E-300-4X2MA 及UFP-E-500-4X2MA。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

（2）方法。將BVDV NMG 株按1%比例接種至長成致密單層的MDBK 細(xì)胞中，置37 培養(yǎng)1 小時；棄去培養(yǎng)液，用0.01molLPBS 沖洗去除牛血清，加入維持液（含2%胎牛血清的DMEM）。待細(xì)胞病變達(dá)到90%以上時，反復(fù)凍融3 次，收獲病毒液。將收獲的BVDV 病毒液合并后分為2 份，每份4L。分別用300NMWC 中空纖維超濾柱和500NMWC 中空纖維超濾柱進(jìn)行濃縮，最終濃縮倍數(shù)為10 倍。采用凱氏定氮法測定BVDV 原液、濃縮液和透過液中的蛋白含量，并計算蛋白去除率。使用MDBK 細(xì)胞測定BVDV原液、濃縮液和透過液中病毒TCID50，并按照Reed-Muench 法計算。

2 結(jié)果與分析

（1）透過液中病毒TCID50 檢測結(jié)果。300NMWC超濾膜和500NMWC 超濾膜濃縮過程中，透過端料液接種MDBK 細(xì)胞后均未產(chǎn)生細(xì)胞病變。300NMWC中空纖維系統(tǒng)超濾濃縮后，平均蛋白去除率為65.9%,平均病毒滴度為5.17；500NMWC 中空纖維系統(tǒng)超濾濃縮后，平均蛋白去除率為72.8%,平均病毒滴度為5.42。結(jié)果表明，500NMWC 中空纖維系統(tǒng)具有更高的蛋白去除率和病毒回收率。具體結(jié)果見表1 和表2。

表1 300K BVDV 原液、濃縮液蛋白含量及病毒TCID50 測定結(jié)果

表2 500K BVDV 原液、濃縮液蛋白含量及病毒TCID50 測定結(jié)果

3 討論

超濾濃縮工藝是較為常見的病毒或者抗原濃縮技術(shù)手段，該工藝已用于狂犬病毒疫苗、流感疫苗等疫苗的純化和濃縮，并取得了良好的蛋白去除效果和抗原濃縮效果[2,3]。由于病毒增殖后收獲液中存在大量的雜蛋白成分，制成疫苗后這些成分會導(dǎo)致較為嚴(yán)重的副反應(yīng)[4]。濃縮后的病毒液或者抗原液有效成分含量有所提高，降低雜蛋白含量，從而提高疫苗的免疫效果。本試驗比較了300NMWC 和500NMWC 中空纖維超濾膜在BVDV 濃縮過程中的區(qū)別。結(jié)果表明，500NMWC 中空纖維系統(tǒng)具有更高的蛋白去除率和病毒回收率。另外，500NMWC 中空纖維系統(tǒng)濃縮時間更短，剪切力更小，這也是500NMWC 中空纖維膜回收率較高的原因。綜上所述，本試驗初步解決了BVDV 中空纖維超濾濃縮工藝柱選型問題，為未來BVDV 純化工作奠定了基礎(chǔ)。

[1]Bachofen,C.,H.Stalder,H.R.Vogt,et al.Bovine viral diarrhea(BVD)from biology to control[J].Berl Munch Tierarztl Wochenschr ,2003,126(11-12):452-461.

[2]張磊，黃林，周蘭斌，等.人用Vero 細(xì)胞狂犬病疫苗純化工藝的建立［J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志,2003,19(3):198-199.

[3]張鈺,羅德炎,劉俊生,等.人用禽流感裂解疫苗生產(chǎn)工藝的研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2006.,31(12):1209-1210.

[4]任培森；呂文靜；丁壯.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗純化濃縮效果的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2013,35(2):103-106.