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        毛尖蘑粗多糖對H22肝癌小鼠 TNF-α和IL-2表達的影響①

        2015-02-18 05:29:44羅文哲王建杰呂冬霞
        黑龍江醫(yī)藥科學 2015年4期
        關鍵詞:毛尖荷瘤多糖

        羅文哲 ,王建杰, 呂冬霞

        (佳木斯大學基礎醫(yī)學院,黑龍江 佳木斯 154007)

        毛尖蘑粗多糖對H22肝癌小鼠 TNF-α和IL-2表達的影響①

        羅文哲 ,王建杰, 呂冬霞

        (佳木斯大學基礎醫(yī)學院,黑龍江 佳木斯 154007)

        目的:研究毛尖蘑粗多糖對H22肝癌小鼠 TNF-α和IL-2表達的影響。方法:建立小鼠肝癌模型,并隨機分為4組:陰性對照組、陽性對照組、毛尖蘑粗多糖低(20mg/mL)、高劑量組(40mg/mL),每組10只。于接種后24h給予不同處理,每日1次,腹腔注射。14d后,采用ELISA法測定血清中TNF-α與IL-2水平,RT-PCR對外周血單個核細胞(PBMC)TNF-α與IL-2 mRNA表達進行檢測。結果:模型對照組血清中IL-2 水平低于正常對照組(P<0.05),TNF-α水平變化不明顯,毛尖蘑粗多糖組TNF-α和IL-2水平高于模型對照組(P<0.05)。PBMC中TNF-α和IL-2mRNA在毛尖蘑粗多糖組高于模型對照組(P<0.05)。結論:毛尖蘑粗多糖能促進TNF-α和IL-2 分泌而發(fā)揮了抗腫瘤作用。

        毛尖蘑粗多糖;肝癌;細胞因子

        毛尖蘑,別名金子蘑,是一種罕見的野生珍稀食用真菌。在前期研究工作中,我們對毛尖蘑中的粗多糖進行了提取,并發(fā)現(xiàn)其對H22荷瘤小鼠的腫瘤生長有抑制作用[1,2],但對免疫功能的影響尚未見報道。因此,本研究通過建立小鼠H22肝癌模型,采用ELISA、RT-PCR方法,對荷瘤小鼠外周血中TNF-α與IL-2水平、以及相應的mRNA進行了檢測,以闡明毛尖蘑粗多糖如何影響H22肝癌小鼠的免疫功能,為毛尖蘑粗多糖的抗腫瘤作用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        毛尖蘑子實體購于大興安嶺呼瑪縣韓家園林業(yè)局松濤鹿苑公司。環(huán)磷酰胺(CTX)為上海華氏制藥有限公司天平制藥廠產(chǎn)品。紅細胞裂解液、淋巴細胞分離液購于上海新睿生物科技有限公司。TNF-α、IL-2酶聯(lián)免疫雙抗體夾心(ELISA)試劑盒購于深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司。總RNA提取試劑盒、反轉錄cDNA合成試劑盒購于Promega生物公司。Trizol試劑購于Invitrogen公司。β-actin多克隆抗體來自北京北京康為世紀生物科技有限公司。昆明種小鼠雌性為佳木斯大學實驗動物中心提供。小鼠H22肝癌細胞株為哈爾濱醫(yī)科大學腫瘤研究所惠贈。

        1.2 方法

        1.2.1 毛尖蘑粗多糖提取

        根據(jù)文獻報道,采用熱水浸提方法改良[1]。

        1.2.2 建立小鼠肝癌模型以及藥物處理

        將小鼠腹水瘤以生理鹽水制成腫瘤細胞懸液,濃度5×106個/mL,注于小鼠右前肢腋下0.2mL/只,制作荷瘤鼠模型,共40只。24h后,將小鼠隨機分成4組,每組以不同的處理因素進行干預,一組為腫瘤對照組(對照組):無任何干預;一組為陽性藥物對照組(CTX組):給予CTX,25mg/kg·d,每日1次,腹腔注射;其他兩組為毛尖蘑粗多糖低劑量、高劑量組:低劑量組給予毛尖蘑粗多糖20mg/mL,高劑量給予40mg/mL,腹腔注射,每日1次,連續(xù)14d。每日觀察,隔日稱重。

        1.2.3 檢測荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2的水平

        各組小鼠14d后,外周血采血,4 ℃、3,000r/min離心10min,吸取血清,ELISA法檢測各組小鼠血清中TNF-α和IL-2的水平,實驗步驟按試劑盒說明書操作。

        1.2.4RT-PCR檢測TNF-α、IL-2mRNA的表達

        應用淋巴細胞分離液分離小鼠的外周血中的PBMC,調(diào)整細胞濃度至2×106個細胞/mL,于24孔細胞培養(yǎng)板中各加0.5mL的細胞懸液,在培養(yǎng)箱中(5%CO2、37 ℃)培養(yǎng)48h。加入Trizol,按照說明書提取細胞的總RNA。應用一步法反轉錄試劑盒轉錄,PCR擴增,25μL為總反應體積。TNF-α引物序列(460bp):上游:5’-TGGCCCAGACCCTCACA-3’,下游:5’-TGCCCGGACTCCGTGAT-3’;IL-2引物序列(502bp):上游: 5`-ATGTACAGCATGCAGCTCGCATC-3`,下游: 5`-GGCTTGTTGAGATGATGCTTTGACA-3`;β-actin序列:上游: 5`-ATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3`,下游: 5`-CGCCTAGAAGCACTTGCGGTG-3`。TNF-α的反應條件為94 ℃變性30s,55 ℃退火30s, 72 ℃延伸30s,共30個循環(huán),72 ℃延伸5min。4 ℃終止。IL-2的反應條件為94 ℃變性30s,57 ℃退火45s,72 ℃延伸30s,共30個循環(huán),72 ℃延伸7min。4 ℃終止。內(nèi)參為β-actin。應用圖像灰度掃描系統(tǒng)進行灰度值測定,計算與β-actin比值,得到mRNA相對含量。

        1.3 統(tǒng)計學方法

        2 結果

        2.1 毛尖蘑粗多糖的提取

        用苯酚-硫酸法測定了毛尖蘑子實體中提取的固形物中多糖的含量為97.5%。

        2.2 血清中IL-2 和 TNF-α的變化

        IL-2 水平在模型組低于正常組(P<0.05),TNF-α無明顯變化,毛尖蘑粗多糖組IL-2 和TNF-α較模型組明顯增加(P<0.05)。

        表1 毛尖蘑粗多糖對小鼠血清IL-2和TNF-α水平的影響

        注:與模型比較,*P<0.05;與正常組比較,#P<0.05。

        2.3 TNF-α 和IL-2 mRNA的表達

        如表2、圖1顯示,IL-2、TNF-α的PCR結果在502bp和460bp處出現(xiàn)條帶,條帶灰度值經(jīng)掃描分析,差異具有顯著性(P<0.01)。

        圖1PBMC中IL-2、TNF-αmRNA表達

        表2 毛尖蘑粗多糖對PBMC IL-2、TNF-αmRNA表達的影響

        注:與模型對照組比較,**P<0.01

        3 討論

        研究顯示,TNF-α與IL-2是免疫系統(tǒng)中起重要作用的調(diào)節(jié)因子,調(diào)節(jié)T、B細胞的增殖、分化等免疫功能,并參與各種免疫反應以及炎癥反應。腫瘤免疫中,TNF-α與IL-2二者協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。經(jīng)過炎癥介質、內(nèi)毒素、白細胞介素-1等物質的刺激,單核/巨噬細胞活化,活化后主要分泌腫瘤壞死因子,它是一種小分子蛋白質。根據(jù)不同的基因結構及功能, 腫瘤壞死因子分為TNF-α、TNF-β兩種。單核/巨噬細胞主要分泌的是TNF-α, 而TNF-β主要由活化的T淋巴細胞產(chǎn)生。TNF-α具有直接的抗腫瘤作用,以自分泌的方式作用于分泌的細胞,在病變部位產(chǎn)生,并集中于局部區(qū)域,具有選擇性,被認為是一種多功能的細胞因子[4]。IL-2為T細胞生長因子,對T細胞的活化、增殖具有促進作用,是重要的可溶性因子,也是細胞因子網(wǎng)絡性調(diào)節(jié)的核心,對細胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫功能具有重要意義。目前,國內(nèi)外文獻報道顯示, 晚期腫瘤患者或者荷瘤動物體內(nèi)IL-2產(chǎn)生的含量明顯比正常人低,同時,IL-2 活性也明顯低于正常人, 這可能是癌癥晚期患者或者荷瘤動物誘生了某些抑制性的細胞群,這些細胞群產(chǎn)生了免疫抑制因子,非特異性抑制了IL-2產(chǎn)生與活性,或者因為IL-1等這些IL-2生成必需的淋巴因子活性減弱引起[5]。 毛尖蘑是黑龍江省特有的食、藥用真菌,天然綠色食品。其多糖具有抗腫瘤,保肝護肝,增強免疫力等作用[2]。對此,我們進一步研究了毛尖蘑粗多糖組對TNF-α和IL-2的影響,經(jīng)過實驗證明,荷瘤小鼠在灌胃2周后,TNF-α和IL-2水平明顯升高,mRNA表達增強。由此,我們可以認為,毛尖蘑粗多糖促進免疫細胞分泌TNF-α和IL-2,這是通過促進了外周血單個核細胞的TNF-α和IL-2mRNA的轉錄。毛尖蘑粗多糖能通過調(diào)節(jié)TNF-α和IL-2分泌發(fā)揮了抗腫瘤作用。

        [1]范曉艷,呂冬霞,劉爽,等. 毛尖蘑粗多糖提取方法的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2010,33(4): 20-21

        [2]呂冬霞,范曉艷,金岳雷,等. 毛尖蘑子實體粗多糖對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用[J].中國老年學雜志,2012,32(11):2303-2304

        [3]MargolinKA.Interleukin-2inthetreatmentofrenalcancer[J].SeminOncol,2000,27(2):194-203

        [4]孫云暉,代立娟. 肺癌中PPAR-和TNF-的表達及臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2008,31(1):12-13

        [5]王麗娟,孫蕾,王振東.葛根素對U14宮頸癌小鼠免疫和氧化功能的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2011,34(4):42-43

        佳木斯大學校級重點項目,編號:Sz2013-002。

        羅文哲(1976~)男,黑龍江佳木斯人,在讀碩士研究生,副教授。

        呂冬霞(1965~)女,黑龍江佳木斯人,博士,教授,碩士研究生導師。E-mail: luo228071luo@163.com

        R737.9

        A

        1008-0104(2015)04-0037-02

        2014-12-22)

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