葛曉東，李妹玲，鄧小林，吳曉鳳，曾丹妮，廖蕤堃，文　明，李少林

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科，重慶 400016

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外加磁場對SPIO-shRNA分子探針轉染卵巢癌SKOV3細胞的影響

葛曉東，李妹玲，鄧小林，吳曉鳳，曾丹妮，廖蕤堃，文明，李少林

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科，重慶 400016

摘要：目的探討外加磁場對SPIO-shRNA分子探針轉染人卵巢癌SKOV3細胞的影響。方法設定質量濃度為45 mg/L的SPIO-shRNA分子探針轉染人卵巢癌SKOV3細胞，并將SKOV3細胞分為3組：未轉染的細胞組(空白對照組)，SPIO-shRNA分子探針轉染的細胞組(陰性對照組)，培養(yǎng)皿底部外加磁場的SPIO-shRNA分子探針轉染的細胞組(實驗組)。采用流式細胞術檢測細胞轉染率，CCK- 8法檢測細胞增殖及活性，Western blot法檢測細胞表皮生長因子受體(EGFR)蛋白水平，熒光定量PCR檢測EGFR mRNA 水平，磁共振(MR)掃描檢測細胞內信號強度變化。結果與陰性對照組比較，實驗組的細胞轉染率[(79.20±3.31)%]顯著增加(P=0.001)；實驗組的細胞活性(P=0.011)、EGFR蛋白及mRNA表達量均明顯降低(P均<0.05)；實驗組的MR圖像信號強度明顯降低( P=0.0004)。結論外加磁場可以誘導SPIO-shRNA分子探針進入卵巢癌SKOV3細胞，從而提高細胞的轉染率。

關鍵詞：分子探針；磁場；SKOV3細胞；轉染

ActaAcadMedSin，2015,37(1)：12-16

分子影像學能夠在無創(chuàng)條件下，早期可視化疾病的特異性分子變異及病理改變過程，是近年研究熱點，而實現(xiàn)分子成像的關鍵技術之一是制備特異性高、親和力強的分子探針[1- 2]。本課題組前期已經(jīng)成功制備出針對人卵巢癌SKOV3細胞表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的磁性納米分子探針(SPIO-shRNA分子探針)，考慮到在隨后的活體動物實驗中，外周靜脈注射的分子探針的體內循環(huán)時間較長，可能會影響到達病變部位的探針濃度，因此有必要通過某種誘導方式，來提高分子探針的靶向劑量。磁轉染是指通過外部磁場作用，使包含基因等的磁性納米粒子載體聚集在靶向細胞附近，促進其被靶向細胞攝取，具有轉染效率高、靶向性強及安全性好等優(yōu)點[3]。本研究通過觀察在外加磁場條件下，SPIO-shRNA分子探針體外轉染人卵巢癌SKOV3細胞的能力，探討提高SPIO-shRNA分子探針轉染效率的方法，以期為活體動物實驗提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。

材料和方法

材料SPIO-shRNA分子探針由本課題組合成[2]。人卵巢癌SKOV3細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。RPMI- 1640培養(yǎng)基及胎牛血清(美國Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，兔抗人EGFR抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，CCK- 8試劑盒(上海BestBio貝博生物公司)，RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)，PCR引物序列由美國Invitrigon公司合成。CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)，多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)，永磁王釹鐵硼強力磁鐵(上海金昆磁電科技有限公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，3.0 T超導型MR成像儀以及8通道腕關節(jié)線圈(美國GE公司)。

SPIO-shRNA分子探針轉染卵巢癌細胞人卵巢癌SKOV3細胞置于含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期細胞用于實驗。將SKOV3細胞分為3組：未轉染的細胞組(空白對照組)，SPIO-shRNA分子探針轉染的細胞組(陰性對照組)，外加磁場的SPIO-shRNA分子探針轉染的細胞組(實驗組)。磁場條件：在SPIO-shRNA分子探針轉染SKOV3細胞時，于細胞培養(yǎng)皿下固定釹鐵硼磁鐵(25 mm×25 mm×10 mm，B=250 mT)15 min。將各組細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)試驗。

流式細胞儀檢測細胞轉染率轉染24 h后收集各組細胞，直接于流式細胞儀上機檢測。實驗重復3次。陽性熒光細胞數(shù)與總的細胞數(shù)之比即為細胞轉染率。

CCK- 8法檢測細胞活性取200 μl細胞懸液以2.0×103個/ml的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每組設3個復孔，培養(yǎng)12 h后，空白對照組不加探針，陰性對照組及實驗組各孔分別加入SPIO-shRNA分子探針10 μl，同時在實驗組各孔下固定釹鐵硼磁鐵15 min，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。PBS清洗3次，每孔加入10 μl CCK- 8溶液，培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標儀測定450 nm波長處各孔光密度值(optical density，OD值)。細胞活性(%)=[(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)]×100%。

Western blot法檢測EGFR蛋白表達水平分別收集3組細胞(1×106/組)并提取總蛋白，檢測各組蛋白質濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，然后將蛋白電轉印至PVDF膜上，并置于5%脫脂牛奶室溫封閉l h，再加入兔抗人EGFR抗體(稀釋比例1∶400)以及Actin內參蛋白抗體(稀釋比例1∶1000)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋比例1∶1000)孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min，ECL化學發(fā)光，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity one軟件進行灰度值分析，每組重復3次。

熒光定量PCR檢測EGFR mRNA表達水平提取各組細胞總RNA，酶標儀測定RNA濃度和純度，取1 μg RNA采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。各組分別取1 μl cDNA 作為反應模板，分別以EGFR和β-Actin特異性引物進行熒光定量PCR。引物序列：(1)β-Actin：上游序列5’-TGACCCAGATCATGTTTGAGACC- 3’，下游序列5’-GAGTCCATCACGATGCCAGTAG- 3’；(2)EGFR：上游序列5’-CCAAGGCACGAGTAACAAGC- 3’，下游序列5’-AGGGCAATGAGGACATAACCAG- 3’。反應條件：預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 3 s，退火延伸60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。各組分別選擇3個復孔，記錄各組的循環(huán)閾值Ct，目的基因的表達量用2-△△Ct進行分析，△Ct=CtEGFR-Ctβ-Actin，△△Ct=△CtEGFR-△Ct空白對照組。

體外MR掃描各組細胞使用0.25%胰酶消化，800 r/min離心3 min，棄上清，之后將各組細胞置于1.5 ml含有1%瓊脂糖EP管內，插于自制的泡沫板上并編號，置于3.0 T超導型MR腕關節(jié)線圈中做橫斷位掃描。具體掃描參數(shù)：T2*WI序列，翻轉角度為23°，TE 12 ms，TR 250 ms，F(xiàn)OV 9×9 cm，激勵次數(shù)3，層間距0.5 mm，矩陣 320×224。圖像傳至GE公司ADW 4.6工作站，選擇20 mm2圓形游標為感興趣區(qū)，分別測量同層面各組細胞的信號強度，每個感興趣區(qū)重復測量3次并取平均值。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法,P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

SPIO-shRNA分子探針轉染SKOV3細胞的轉染率空白對照組細胞轉染率為(0.62±0.16)%，陰性對照組細胞轉染率為(62.54±4.92)%，實驗組細胞轉染率為(79.20±3.31)%；與陰性對照組比較，實驗組的細胞轉染率顯著增加(P=0.001)。

SPIO-shRNA分子探針轉染抑制SKOV3細胞活性陰性對照組與實驗組的細胞活性分別為(49.96±8.89)%和(21.36±10.24)%，均明顯低于空白對照組的100%(P均<0.05)，實驗組的細胞活性與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011)。

磁轉染誘導SKOV3細胞內EGFR蛋白水平下降空白對照組、陰性對照組和實驗組細胞EGFR蛋白表達量分別為99.02±0.13、48.62±9.76和22.63±5.98。其中，實驗組細胞EGFR蛋白的表達量明顯低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)(圖1)。

磁轉染誘導SKOV3細胞內EGFR mRNA水平下降以空白對照組作為標準，實驗組及陰性對照組SKOV3細胞中的EGFR mRNA水平均有所降低，表達量分別為22.01±9.61和43.22±14.08，其中，實驗組較陰性對照組EGFR mRNA表達量降低約為21%，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0008)(圖2)。

SPIO-shRNA分子探針轉染SKOV3細胞降低MR圖像信號強度空白對照組、陰性對照組和實驗組磁共振T2*WI圖像信號強度分別為618.88±5.18、148.81±1.22和241.36±1.27。實驗組的細胞信號強度顯著低于陰性對照組(P=0.0004)和空白對照組(P=0.0000)(圖3)。

EGFR：細胞表皮生長因子受體

EGFR：epidermal growth factor receptor

圖 1各組SKOV3細胞EGFR蛋白表達結果

Fig 1EGFR protein expressions in three groups(Western blot analysis)

與陰性對照組比較，aP=0.0008

aP=0.0008 compared with the negative control group

圖 2各組SKOV3細胞EGFR mRNA基因表達水平

Fig 2Expression levels of EGFR mRNA after transfection into SKOV3 cells in three groups

與空白對照組比較，aP=0.0000；與陰性對照組比較，bP=0.0004

aP=0.0000 compared with the blank control group；bP=0.0004 compared with the negative control group

圖 3不同轉染組MR T2*WI成像結果

Fig 3MR T2*WI imaging results in three groups

討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，由于深居盆腔，早期診斷極為困難，找到早期特異性診斷進而早期治療的方法，是提高患者生存率、改善生活質量的關鍵。結合RNA干擾的特異靶向性及MR對SPIO檢測的敏感性，本課題組前期成功合成了SPIO-shRNA分子探針，該探針含有不成對的Fe3+電子，能夠改變組織周圍的磁場環(huán)境，造成弛豫時間明顯縮短，從而在MR圖像上呈現(xiàn)低信號[4]；同時，shRNA進入細胞后產(chǎn)生特異性的RNA干擾效應，能夠抑制基因表達，誘導細胞凋亡[5]。通過一系列檢測結果顯示，該探針同時具有診斷及治療的雙重功能[2]，且SKOV3細胞最佳轉染濃度為45 mg/L。因此，本研究采用質量濃度為45 mg/L SPIO-shRNA分子探針轉染卵巢癌SKOV3細胞，觀察外加磁場對其轉染效率的影響。

SPIO-shRNA分子探針轉染細胞效率的提高可以增強其對卵巢癌診斷及治療的效果。多項研究表明，通過體外實驗在細胞培養(yǎng)皿底部外加磁場，可使細胞的轉染率提高3～36倍不等[6- 13]。分子探針中的磁性顆粒借助外加靜態(tài)磁場，能夠增加其與細胞膜接觸時間以及接觸量，從而提高轉染效率，此方法稱為磁轉染，是近年來興起的一種新的基因物理靶向遞送技術，最早應用于乳腺癌細胞、肝細胞、骨髓間充質干細胞、壺腹癌細胞以及血管內皮生長因子等局部轉染，此外利用該方法進行反義核苷酸體外、體內轉染也取得了較好效果[8]。由此可見，磁轉染是一種提高細胞內探針濃度的有效方法，但其是否也能提高SPIO-shRNA分子探針轉染SKOV3細胞的效率，目前未見相關文獻報道，這也是本研究亟待解決的問題。

通過對各組細胞流式細胞術、Western blot法以及熒光定量PCR檢測結果發(fā)現(xiàn)，外加磁場后，細胞轉染率提高約17%，EGFR蛋白表達量及mRNA水平的抑制率均大于20%，說明外加磁場后，與EGFR結合的探針量明顯增加，從而出現(xiàn)抑制卵巢癌SKOV3細胞EGFR mRNA及蛋白表達的效果，這些結果表明，外加磁場能夠提高細胞的轉染率。鄭潔等[14]在SPIO標記間充質干細胞定向遷移的試驗中，采用CCK- 8法證實外加磁場對SPIO標記細胞的增殖及活性均無負面影響。Schiffer等[15]報道EA2細胞暴露在7 T磁場強度條件下，其增殖和活性同樣未受影響，而本研究CCK- 8實驗結果顯示，加入SPIO-shRNA分子探針后，SKOV3細胞增殖及活性均有所降低，與上述報道結論不一致，這可能與分子探針中的shRNA靶向結合腫瘤細胞內EGFR基因后，抑制EGFR基因表達，誘導細胞凋亡有關。此外，本研究CCK- 8檢測結果還顯示，外加磁場后，實驗組細胞活性明顯低于陰性對照組，提示實驗組可能有更多的SPIO-shRNA分子探針進入細胞，間接說明外加磁場可能會增加細胞的轉染率。

本研究MR掃描結果顯示，實驗組信號強度最低，且與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，這是由于在外加磁場作用下，進入SKOV3細胞內的分子探針數(shù)量明顯增加，F(xiàn)e3+改變了周圍磁場環(huán)境，產(chǎn)生磁敏感效應，導致信號強度降低，這也進一步證明了外加磁場能夠增加探針的轉染率。

綜上，在外加磁場作用下，SPIO-shRNA分子探針更易靶向進入SKOV3細胞內，進而提高細胞的轉染率。當然，本實驗是在體外培養(yǎng)條件下進行的，可能會與體內實驗條件存在差異，外加磁場能否對SPIO-shRNA分子探針活體轉染實體腫瘤組織產(chǎn)生影響，以及最佳的外部磁場強度及磁化時間等問題，將是今后重要的研究方向之一。

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·論著·

Effects of External Magnetic Field on the Transfection Rate of SPIO-shRNADual Functional Molecular Probe into Ovarian Carcinoma SKOV3 Cells in Vitro

GE Xiao-dong，LI Mei-ling，DENG Xiao-lin，WU Xiao-feng，ZENG Dan-ni，LIAO Rui-kun，WEN Ming，LI Shao-lin

Department of Radiology，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Corresponding author：WEN MingTel：023- 89013721，E-mail：13883669699@163.com

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the transfection rate of SPIO-shRNA dual functional molecular probe into ovarian carcinoma SKOV3 cells in external magnetic field. MethodsDual functional molecular probe at an iron concentration of 45 mg/L was transfected into SKOV3 cells. The cells with coexisting probe and magnetic fields were set as the intervention group，the probe-transfected cells as negative control group，and normally cultured SKOV3 without any transfection as blank control group. The transfection rate was detected by flow cytometry. Cell viability was observed by CCK- 8 assay. Epidermal growth factor receptor(EGFR) expression level in SKOV3 cells was determined by real-time quantitative PCR and Western blot analysis.The signal intensity was measured by magnetic resonance imaging(MRI). ResultsThe transfection rate of the intervention group was (79.20±3.31)%，which was significantly higher than that of negative control group(P=0.001). Compared with the negative control group，the cell viability of the intervention group significantly decreased(P=0.011), protein and mRNA expression levels of EGFR in the intervention group were significantly decreased(both P<0.05). The signal intensity on T2*WI in the intervenion group also significantly decreased(P=0.0004). ConclusionThe external magnetic field can improve the transfection efficiency SPIO-shRNA dual functional molecular probe into ovarian carcinoma SKOV3 cells.

Key words：molecular probe；magnetic field；SKOV3 cells；transfection

收稿日期：(2014- 05- 22)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.01.003

中圖分類號:R737.3

文獻標志碼:A

文章編號：1000- 503X(2015)01- 0012- 05

通信作者：文明電話：023- 89013721，電子郵件：13883669699@163.com

基金項目：國家自然科學基金(81171366)和國家臨床重點?？平ㄔO項目(2013- 544)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81171366)and the National Clinical Key Subject Construction Project(2013- 544)