羅建峰　吳華杰　石曌玲

張敏龍2　金發(fā)光2

1,25-二羥維生素D3抑制RhoA/ROCK通路減輕幼鼠海水淹溺型肺損傷的實驗研究

羅建峰1吳華杰1石曌玲1

張敏龍2金發(fā)光2

淹溺是全球第三大意外死亡原因。據(jù)報道，每年因淹溺導致的死亡人數(shù)接近150萬，目前也是我國0～14歲年齡組人群第一位的死因，而海水淹溺導致的死亡在其中占據(jù)了一大部分[1- 2]。呼吸心搏驟停是淹溺兒童致死最常見原因，而存活下來的患兒往往合并急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。前期大量研究表明，海水吸入導致了肺組織屏障通透性的增加，從而引起了肺泡腔和肺間質(zhì)嚴重的水腫。

RhoA/ROCK (Rho-associated coil forming protein kinase) 通路是鈣敏感的信號通路，該通路通過影響肌球蛋白ATP酶的活性對細胞骨架收縮反應進行調(diào)控[3]。在細胞骨架收縮反應中，ROCK引起肌球蛋白輕鏈(light-chain of myosin, MLC)的磷酸化，而磷酸化的MLC最終促進了肌球蛋白ATP酶的激活，從而導致細胞骨架蛋白的重組、張力纖維成型以及細胞的收縮[4]。因此，RhoA/ROCK信號通路在細胞屏障通透性的增加中起到了重要作用。另外，研究證實RhoA/ROCK信號通路在炎癥反應的調(diào)節(jié)方面也有明顯的效果。

1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2VitD3]除了已知的調(diào)節(jié)鈣和磷的代謝外，還具有免疫調(diào)節(jié)的功能。已有研究表明，1,25-二羥維生素D3在抑制中性粒細胞的浸潤和炎癥因子的產(chǎn)生方面有著顯著作用[5-6]。本實驗觀察了1,25-二羥維生素D3對于肺組織水腫和通透性的影響，并且進一步探討了RhoA/ROCK信號通路在海水吸入型肺損傷中的相關(guān)作用機制。在我們之前的研究中，地塞米松已經(jīng)被證實對于海水吸入型肺損傷具有良好的干預效果[7-8]。因此，本課題組選擇了該藥物作為陽性治療對照。

材料與方法

一、實驗材料

選擇健康雄性21日齡SD(Sprague-Dawley)幼鼠32只，清潔級，體質(zhì)量44～61 g，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。1,25-二羥維生素D3(HPLC≥99%)和地塞米松(HPLC≥98%)均購自Sigma公司，1,25-二羥維生素D3灌注液用10%甲醇-1‰Triton X-100溶液制成，地塞米松灌注液用5‰羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose)溶液制成。配方海水根據(jù)中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水的主要成分配制：NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，NaBr 0.083 g/L；pH 8.2，相對密度1.05，滲透壓1 300 mmol/L。炎癥因子 ELISA試劑盒購于R&D公司。β-actin、RhoA、MYPT-1和磷酸化MYPT-1(p-MYPT1)抗體均購于Santa Cruz公司。

二、實驗動物分組

用完全隨機方法將實驗幼鼠共32只分為四組，每組8只：A：空白對照組，B：海水處理組，C：VitD3處理組，D：地塞米松處理組。各組幼鼠分別在海水滴入前1h灌胃處理：A和B組：生理鹽水；C組：25 μg/kgVitD3；D組：10 mg/kg地塞米松。幼鼠海水肺損傷模型的制備：幼鼠通過腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)進行麻醉，仰臥固定，氣管切開插入氣管導管后維持自主呼吸，后取1 ml的注射器插入氣管，在4 min之內(nèi)緩慢注入3 ml/kg海水。模型制備完成后，放血處死并切取肺組織。

三、檢測指標及方法

1. 肺組織濕干重比值(W/D ratio)測定：取每只幼鼠右肺上葉，濾紙吸去表面水分和血跡，電子天平稱濕重，后置于55 ℃烘干箱中72 h至恒重，稱量干重，分別以濕重除以干重即為濕干比。

2. 伊文思藍法檢測肺組織通透性：在各組幼鼠處死前，將伊文思藍(20 mg/kg體重)靜脈注射到幼鼠體內(nèi)，迅速取出幼鼠肺組織并用生理鹽水注射入右心室，沖洗肺組織，直到左心房流出液為無色透明為止。之后，將肺組織在60 ℃下干燥72 h，干肺稱重后被放入60 ℃甲酰胺中(3 ml/100 mg)，上清液以離心半徑8 cm，1 200 r/min離心30 min，在620 nm檢測光密度值，通過比對伊文思藍標準曲線得出各樣本中伊文思藍濃度(μg/g組織)。

3. TNF-α和IL-1β檢測：用ELISA試劑盒檢測肺組織TNF-α和IL-1β的含量，上述測量過程嚴格按照試劑盒相關(guān)說明要求操作。

4. Western-blot檢測RhoA、GTP-RhoA、MYPT-1和p-MYPT1蛋白表達：幼鼠肺組織用裂解液處理，裂解產(chǎn)物離心(以離心半徑8 cm，1 200 r/min離心30 min，4 ℃)，收集上清。將等量的不同蛋白進行SDS-PAGE電泳，之后在100 V電壓低溫下轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，用5%的脫脂牛奶封閉2 h。加入1︰1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，反復洗脫后，加入1︰5 000稀釋的羊抗兔二抗，37 ℃溫育1 h，用ECL系統(tǒng)顯色，避光保存并照相，做灰度掃描處理，結(jié)果用目的蛋白與β-actin的相對比值表示。RhoA活性檢測采用Rho pull-down (Upstate Biotechnology公司)分析法檢測，具體步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

五、統(tǒng)計學方法

結(jié)果

一、肺組織濕干比值(W/D ratio)和肺組織通透性結(jié)果

各組幼鼠氣管內(nèi)滴入海水4 h后，肺組織濕干比和伊文思藍通透性明顯增加(P<0.001)，VitD3和地塞米松能夠明顯降低肺組織濕干比和通透性，但VitD3與地塞米松治療效果無顯著差異，見圖1。

圖1各組幼鼠肺組織濕干比值(W/D)和肺組織通透性結(jié)果，A：空白對照組，B：海水4 h組，C：VitD3處理組，D：地塞米松處理組n=8；***P<0.001vs. 空白對照組；###P<0.001，##P<0.01vs. 海水4 h組

二、炎癥因子檢測結(jié)果

海水處理4 h后幼鼠肺組織勻漿中TNF-α和IL-1β的含量顯著增加(P<0.001)，VitD3和地塞米松明顯抑制了炎癥因子的表達(P<0.05)，VitD3與地塞米松治療效果無顯著差異，見圖2。

圖2各組幼鼠肺組織炎癥因子檢測結(jié)果，A：空白對照組，B：海水4 h組，C：VitD3處理組，D：地塞米松處理組n=8；***P<0.001vs. 空白對照組；##P<0.01，#P<0.05vs. 海水4 h組

三、RhoA活性檢測結(jié)果

海水處理4 h后幼鼠肺組織中GTP-RhoA表達顯著增加(P<0.001)，VitD3和地塞米松能夠明顯抑制RhoA的激活(P<0.05)，但VitD3效果好于地塞米松(P<0.05)，見圖3。

圖3各組幼鼠肺組織活性RhoA檢測結(jié)果，A：空白對照組，B：海水4 h組，C：VitD3處理組，D：地塞米松處理組n=8；***P<0.001vs. 空白對照組；###P<0.001，#P<0.05vs. 海水4 h組；○P<0.05vs. 地塞米松處理

四、MYPT-1磷酸化檢測結(jié)果

MYPT-1(myosin phosphatase target subunit 1)作為肌球蛋白輕鏈磷酸酶調(diào)節(jié)亞單位，是RhoA信號通路的下游效應分子。海水處理4 h后幼鼠肺組織中p-MYPT1表達明顯增加(P<0.001)，VitD3和地塞米松能夠顯著抑制MYPT-1的激活(P<0.05)，但VitD3效果好于地塞米松(P<0.05)，見圖4。

圖4各組幼鼠肺組織磷酸化MYPT-1檢測結(jié)果，A：空白對照組，B：海水4 h組，C：VitD3處理組，D：地塞米松處理組n=8；***P<0.001vs. 空白對照組；###P<0.001vs. 海水4 h組；○P<0.05vs. 地塞米松處理組

討論

小兒海水淹溺后會發(fā)生一系列的病理變化，其中最主要的是炎癥反應和肺組織屏障通透性增加引起的肺組織水腫。高滲的海水吸入肺泡時，通過高滲效應和肺屏障通透性的破壞，會使大量液體和炎癥細胞滲出，并在肺泡腔和肺間質(zhì)集聚，同時這些炎癥細胞分泌大量的炎癥因子和活性氧基團，進一步加重了肺損傷。這表明了肺組織屏障的破壞是海水吸入肺損傷的關(guān)鍵發(fā)病環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)海水吸入后，幼鼠肺組織濕干比顯著增加，肺組織屏障通透性也明顯增加，同時炎癥因子的表達也增高。而1,25-二羥維生素D3則減輕了肺組織的炎癥和水腫反應。

目前治療上除機械通氣外，規(guī)范的藥物治療仍在進一步研究中[9]。1,25-二羥維生素發(fā)揮免疫調(diào)控的作用是通過與細胞核內(nèi)維生素D受體相結(jié)合，從而進一步調(diào)控其下游基因發(fā)揮效應[10]。近期諸多研究表明，在人類白細胞、樹突狀細胞、以及成纖維細胞中，1,25-二羥維生素D3主要起抑制炎癥反應以及調(diào)節(jié)免疫的作用[11-14]。此外，1,25-二羥維生素D3在前列腺細胞增生過程中可抑制細胞骨架的重構(gòu)[15]。

RhoA分子屬于小分子G蛋白家族，主要通過其下游效應分子Rho激酶ROCK發(fā)揮作用。ROCK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。激活狀態(tài)的RhoA即GTP-RhoA與ROCK結(jié)合，進一步磷酸化其下游底物MYPT-1，從而調(diào)節(jié)細胞的多種行為，包括細胞形狀改變、遷移等[3]。近年來多個研究表明，RhoA/ROCK信號通路在炎癥反應的調(diào)節(jié)以及細胞骨架重構(gòu)方面也有著重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)海水刺激可導致幼鼠肺組織中RhoA分子的激活，同時引起其下游MYPT-1分子的磷酸化。而1,25-二羥維生素D3可顯著的抑制了肺組織中RhoA分子的激活，同時也抑制MYPT-1分子的磷酸化。綜上，這些實驗結(jié)果證明RhoA/ROCK信號通路在幼鼠海水淹溺型肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。同時也部分解釋了1,25-二羥維生素D3在幼鼠海水淹溺型肺損傷中的作用機制，并且為1,25-二羥維生素D3在小兒海水淹溺型肺損傷的臨床應用提供了實驗依據(jù)。

參考文獻

1van Beeck EF, Branche CM, Szpilman D, et al. A new definition of drowning: towards documentation and prevention of a global public health problem[J]. Bull World Health Organ, 2005, 83(11): 853-856.

2Orlowski JP, Szpilman D. Drowning. Rescue, resuscitation, and reanimation[J]. Pediatr Clin North Am, 2001, 48(3): 627-646.

3Amano M, Chihara K, Kimura K, et al. Formation of actin stress fibers and focal adhesions enhanced by Rho-kinase[J]. Science, 1997, 275(5304): 1308-1311.

4Amano M, Ito M, Kimura K, et al. Phosphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase (Rho-kinase)[J]. J Biol Chem, 1996, 271(34): 20246-20249.

5Takano Y, Mitsuhashi H, Ueno K. 1alpha, 25-Dihydroxyvitamin D(3) inhibits neutrophil recruitment in hamster model of acute lung injury[J]. Steroids, 2011, 76(12): 1305-1309.

6張敏龍, 王莉, 金發(fā)光. 1,25-二羥維生素D3調(diào)節(jié)NF-κB通路對減輕海水吸入型急性肺損傷的作用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2014, 7(5): 512-517.

7金發(fā)光, 郭佑民. 地塞米松調(diào)節(jié)claudin-4減輕海水淹溺性肺水腫的機制研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2013, 6(2): 124-129.

8王莉, 張敏龍, 金發(fā)光. 地塞米松通過加強自噬和抑制凋亡減輕海水吸入型肺損傷[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2014, 7(6): 627-631.

9Sprung CL, Annane D, Keh D, et al. Hydrocortisone therapy for patients with septic shock[J]. N Engl J Med, 2008, 358(2): 111-124.

10Lips P. Vitamin D physiology[J]. Prog Biophys Mol Biol, 2006, 92(1): 4-8.

11Rostkowska-Nadolska B, Sliupkas-Dyrda E, Potyka J, et al. Vitamin D derivatives: calcitriol and tacalcitol inhibits interleukin-6 and interleukin-8 expression in human nasal polyp fibroblast cultures[J]. Adv Med Sci, 2010, 55(1): 86-92.

12Fukuoka M, Ogino Y, Sato H, et al. Regulation of RANTES and IL-8 production in normal human dermal fibroblasts by active vitamin D3 (tacalcitol)[J]. Br J Pharmacol, 1998, 124(7): 1433-1438.

13Takahashi K, Horiuchi H, Ohta T, et al. 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 suppresses interleukin-1beta-induced interleukin-8 production in human whole blood: an involvement of erythrocytes in the inhibition[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2002, 24(1): 1-15.

14Dong X, Craig T, Xing N, et al. Direct transcriptional regulation of RelB by 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and its analogs: physiologic and therapeutic implications for dendritic cell function[J]. J Biol Chem, 2003, 278(49): 49378-49385.

15Penna G, Fibbi B, Amuchastegui S, et al. The vitamin D receptor agonist elocalcitol inhibits IL-8-dependent benign prostatic hyperplasia stromal cell proliferation and inflammatory response by targeting the RhoA/Rho kinase and NF-kappaBpathways[J]. Prostate, 2009, 69(5): 480-493.

(本文編輯：張大春)

羅建峰，吳華杰，石曌玲，等. 1,25-二羥維生素D3通過抑制RhoA/ROCK通路減輕幼鼠海水淹溺型肺損傷[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(5)： 565-568.

·論著·

【摘要】目的探討1,25-二羥維生素D3對幼鼠海水吸入型肺損傷的干預作用及其機制。方法32只SD幼鼠隨機分為空白對照組、海水處理組、活性VitD3處理組和地塞米松處理組，每組8只。海水處理組幼鼠給予氣管內(nèi)灌注3 ml/kg海水，VitD3處理組和地塞米松處理組在海水處理組的基礎上分別給予25 μg/kg VitD3和10 mg/kg地塞米松灌胃處理。分別檢測各組肺組織濕干比和通透性變化，ELISA法檢測肺組織中炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞-1β(IL-1β)的表達，Western blot檢測GTP-RhoA和磷酸化MYPT-1的表達變化。結(jié)果與正常對照組比較，海水氣管內(nèi)滴入4 h后幼鼠肺部組織出現(xiàn)明顯炎癥和水腫，炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達顯著增高，RhoA的活化和MYPT-1磷酸化增加；1,25-二羥維生素D3和地塞米松干預可顯著減輕海水導致的肺組織損傷，減少了TNF-α和IL-1β的釋放，并且抑制了RhoA的活化和MYPT-1的磷酸化。結(jié)論RhoA/ROCK通路參與幼鼠海水吸入型肺損傷的發(fā)展，1,25-二羥維生素D3能夠通過調(diào)節(jié)該信號通路減輕肺損傷。

【關(guān)鍵詞】急性肺損傷；海水；1,25-二羥維生素D3；RhoA/ROCK；幼鼠

1,25-(OH)2VitD3alleviates seawater drowning-induced acute lung injury in young rats by inhibiting RhoA/ROCK pathwayLuoJianfeng1,WuHuajie1,ShiZhaoling1,ZhangMinlong2,JinFaguang2.1DepartmentofPaediatrics,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China;2DepartmentofRespiratoryDisease,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China

Correspondingauthor：JinFaguang,Email:jinfag@fmmu.edu.cn

【Abstract】ObjectiveTo observe the therapeutic effect of 1,25-(OH)2VitD3in seawater aspiration-induced acute lung injury of young rats and explore the possible mechanisms. MethodsYoung SD rats were randomly divided into 4 groups, 8 in each group: control group, seawater group, VitD3pre-treated group and dexamethasone pre-treated group. Seawater (3 ml/kg) was instilled into the airway of young rats in seawater group. Rats in VitD3group and dexamethasone group were injected with 25 μg/kg VitD3or 10 mg/kg dexamethasone followed by seawater. W/D ratio and lung tissue permeability detection was carried out after modeling. The expression of TNF-α and IL-1β were measured by ELISA and the expression of GTP-RhoA and phospho-MYPT1 were measured by Western blot. ResultsCompared with control group, lung tissue inflammation and edema were obvious and the expression of TNF-α and IL-1β were increased after 4 h seawater stimulation. The expression of GTP-RhoA and phospho-MYPT1 were up-regulated. However, administration of 1,25-(OH)2VitD3attenuated lung inflammation and edema, suppressed the release of TNF-α and IL-1β, and inhibited the expression of GTP-RhoA and phospho-MYPT1. ConclusionRhoA/ROCK pathway plays important role in the seawater aspiration-induced acute lung injury of young rats and 1,25-(OH)2VitD3attenuated lung injury by inhibiting RhoA/ROCK pathway.

【Key words】Acute lung injury;Seawater;1,25-(OH)2VitD3;RhoA/ROCK;Young rats

收稿日期：(2015-04-10)

文獻標識碼：中圖法分類號： R563 A

通訊作者：金發(fā)光，Email: jinfag@fmmu.edu.cn

基金項目：作者單位： 710032 西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院兒科1;710038 西安，第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科2

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.05.007