李　珍，蘇有勇，曹茂炅，廖小華，馬汶絹，李思梅

(昆明理工大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，云南 昆明 650504)

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超聲波輔助提取紫莖澤蘭中單寧的工藝優(yōu)化

李珍，蘇有勇，曹茂炅，廖小華，馬汶絹，李思梅

(昆明理工大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，云南 昆明 650504)

摘要：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取紫莖澤蘭中單寧的工藝條件。確定最優(yōu)工藝條件為：甲醇濃度75%、提取時(shí)間45 min、液料比90∶1(mL∶g)，在此條件下，紫莖澤蘭中單寧含量為1.58%，與模型預(yù)測(cè)值1.57%相近，RSD為0.06%。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；超聲波輔助提?。蛔锨o澤蘭；單寧

紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum Sprengel)是一種世界公認(rèn)的惡性有毒雜草[1]，其營(yíng)養(yǎng)成分豐富，干物質(zhì)總能量為17.22 MJ·kg-1，鮮草產(chǎn)量達(dá)45 t·hm-2，在我國(guó)分布廣泛[2]。由于紫莖澤蘭含有對(duì)動(dòng)物毒性較大的單寧類(lèi)、香豆素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)毒性成分，降低了其利用價(jià)值[3]。

單寧是一類(lèi)多元酚化合物，具有多種生物活性[4]，高含量單寧對(duì)動(dòng)物具有較強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用和毒副作用[5]。單寧廣泛存在于蔬菜和水果中[6]，已有從藍(lán)莓[7]、石榴[8]、咖啡[9]、葡萄籽[10]、高粱[11]、柿子[12]等中提取單寧的報(bào)道。單寧的提取方法主要有水浴回流提取法[13]、微波輔助法[14]、超聲波輔助法[15]、半仿生提取法[16]等。超聲波通過(guò)空化、振蕩等作用強(qiáng)化單寧的提取，具有快速、高效等特點(diǎn)[17]。因此，作者采用超聲波輔助提取紫莖澤蘭中單寧，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，擬為紫莖澤蘭脫毒資源化提供幫助。

1實(shí)驗(yàn)

1.1　材料、試劑與儀器

2015年1月在昆明郊區(qū)采集自然條件下脫落葉片的紫莖澤蘭秸稈，剪成1~2 cm小段后粉碎過(guò)40目篩，備用。

單寧酸、磷鉬酸、鎢酸鈉、磷酸、無(wú)水碳酸鈉、甲醇、超純水等均為分析純。

HH·S21-Ni-6型電熱恒溫水浴鍋，UT-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，L500型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，SK3200HP型超聲波發(fā)生器，AL204型電子天平。

1.2　單寧的提取

稱(chēng)取適量紫莖澤蘭粉末置于燒杯中，按一定液料比加入一定濃度的甲醇溶液，然后將燒杯放在超聲波發(fā)生器(工作頻率53 kHz、功率150 W，下同)中提取一定時(shí)間后，過(guò)濾分離，收集濾液。

1.3　單寧含量的測(cè)定

取濾液0.5 mL，置于盛有15 mL蒸餾水的25 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入1.25 mL Folin-Denis試劑[18]及2.5 mL飽和碳酸鈉溶液，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min后在285 nm處測(cè)定吸光度。按下式計(jì)算單寧含量(以干基中單寧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示)：

式中：c為顯色溶液的單寧濃度，μg·mL-1；V為顯色溶液體積，mL；V0為樣品提取液體積，mL；V1為測(cè)定時(shí)吸取樣品溶液體積，mL；m為紫莖澤蘭干質(zhì)量，g。

1.4　提取工藝的優(yōu)化

1.4.1單因素實(shí)驗(yàn)

影響單寧提取的主要因素有甲醇濃度、提取時(shí)間和液料比等。分別以甲醇濃度、提取時(shí)間、液料比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。甲醇濃度設(shè)置為40%、50%、60%、70%、80%；提取時(shí)間設(shè)置為40 min、50 min、60 min、70 min、80 min；液料比(mL∶g,下同)設(shè)置為60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1。

1.4.2響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以單寧含量為響應(yīng)值，以甲醇濃度、提取時(shí)間、液料比為自變量，通過(guò)響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化紫莖澤蘭中單寧的提取工藝。

2結(jié)果與討論

2.1　單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1甲醇濃度對(duì)單寧含量的影響

在提取時(shí)間為60 min、液料比為80∶1的條件下，考察甲醇濃度對(duì)單寧含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　甲醇濃度對(duì)單寧含量的影響Fig.1　Effect of methanol concentration on tannin content

由圖1可看出，隨著甲醇濃度的增大，單寧含量逐漸增加；當(dāng)甲醇濃度超過(guò)70%時(shí)，單寧含量略有下降。因此，選擇70%為響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)甲醇濃度中心點(diǎn)。

2.1.2提取時(shí)間對(duì)單寧含量的影響

在甲醇濃度為70%、液料比為80∶1的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)單寧含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　提取時(shí)間對(duì)單寧含量的影響Fig.2　Effect of extraction time on tannin content

由圖2可看出，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，單寧含量先增

加后減少，在提取時(shí)間為50 min時(shí)，單寧含量達(dá)到最多。這是因?yàn)?，在超聲波空化作用下，植物?xì)胞快速分解，長(zhǎng)時(shí)間超聲波作用，溫度升高，單寧被氧化，導(dǎo)致其含量減少。因此，選擇50 min為響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間中心點(diǎn)。

2.1.3液料比對(duì)單寧含量的影響

在甲醇濃度為70%、提取時(shí)間為50 min的條件下，考察液料比對(duì)單寧含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　液料比對(duì)單寧含量的影響Fig.3　Effect of liquid-solid ratio on tannin content

由圖3可看出，隨著液料比的增大，固液接觸面積擴(kuò)大，單寧含量相應(yīng)增加；當(dāng)液料比超過(guò)90∶1時(shí)液相飽和，單寧含量趨于平穩(wěn)。因此，選擇90∶1為響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)液料比中心點(diǎn)。

2.2　響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化超聲波輔助提取紫莖澤蘭中單寧的工藝條件，響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1，設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1　Factors and levels of response surface methodology

2.3　二次回歸模型擬合及顯著性檢驗(yàn)

表2　響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2　Design and results of response surface methodology

超聲波輔助提取紫莖澤蘭中單寧的響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　響應(yīng)面模型的方差分析　Tab.3　ANOVA for response surface model

注：“Pr>F”<0.05為極顯著。

2.4　響應(yīng)面曲線(xiàn)

三因素交互作用的響應(yīng)面曲線(xiàn)如圖4所示。

圖4　三因素交互作用響應(yīng)面曲線(xiàn)Fig.4　Response surface curves of interaction between three factors

由圖4a可看出，當(dāng)固定液料比為90∶1時(shí)，單寧含量隨甲醇濃度的增大而增加;當(dāng)甲醇濃度從50%增大至80%時(shí)，呈二次方程曲線(xiàn)變化;當(dāng)甲醇濃度超過(guò)70%時(shí)，單寧含量趨于穩(wěn)定；甲醇濃度對(duì)單寧含量的影響大于提取時(shí)間，且甲醇濃度與提取時(shí)間交互作用顯著。

由圖4b可看出，當(dāng)固定提取時(shí)間為50 min時(shí)，液料比曲面下降幅度大于甲醇濃度，單寧含量隨液料比的增大而增加，當(dāng)液料比達(dá)到95∶1后液相飽和，單寧含量減少。

由圖4c可看出，當(dāng)固定甲醇濃度為70%時(shí)，液料比曲面坡度比提取時(shí)間曲面坡度大，單寧含量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在超聲波空化作用下，植物細(xì)胞快速分解，長(zhǎng)時(shí)間超聲波作用，溫度升高，單寧被氧化，單寧含量減少。

綜上可知，三因素對(duì)單寧含量的影響大小依次為液料比>甲醇濃度>提取時(shí)間。

2.5　模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，在甲醇濃度為75%、提取時(shí)間為45 min、液料比為90∶1(mL∶g)的最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到紫莖澤蘭中單寧實(shí)際含量為1.58%，與文獻(xiàn)[13]的結(jié)果一致，與預(yù)測(cè)值1.57%相近，RSD為0.06%。說(shuō)明此模型可行，具有較好的適用性。

3結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取紫莖澤蘭中單寧的工藝條件，確定最優(yōu)工藝條件為：甲醇濃度75%、提取時(shí)間45 min、液料比90∶1(mL∶g)，其中液料比為主要影響因素。以單寧含量為響應(yīng)值，以甲醇濃度、提取時(shí)間、液料比為自變量建立模型，回歸效果顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9936。測(cè)得紫莖澤蘭中單寧實(shí)際含量為1.58%，與模型預(yù)測(cè)值的RSD為0.06%。此模型可行且具有較好的適用性。

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10.3969/j.issn.1672-5425.2015.12.011

Optimization on Ultrasonic-Assisted Extraction Process of Tannins

from Eupatorium Adenophorum Sprengel

LI Zhen,SU You-yong，CAO Mao-jiong，LIAO Xiao-hua，MA Wen-juan，LI Si-mei

(Faculty of Modern Agricultural Engineering，Kunming University of

Science and Technology，Kunming 650504，China)

Abstract：Based on single factor experiment,ultrasonic-assisted extraction process of tannins from Eupatorium adenophorum Sprengel was optimized by Box-Behnken central composite experiment and response surface methodology.The optimum conditions were obtained as follows:methanol concentration of 75%,extraction time of 45 min and liquid-solid ratio of 90∶1(mL∶g).Under above conditions,tannin content of Eupatorium adenophorum Sprengel was 1.58%，which was similar to the model predicted value 1.57%,and the relative deviation was 0.06%.

Keywords：indocalamus leaf；total flavonoids;purification；macroporous resin；response surface methodologydoi：

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ 028R 284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2015)12-0047-04

作者簡(jiǎn)介：李珍(1991-)，女，湖北荊州人，碩士研究生，研究方向：生物質(zhì)能，E-mail:lz.117@qq.com；通訊作者：蘇有勇，教授，E-mail:youyongsu@gmail.com。

收稿日期：2015-09-06