譚蕓，朱佳杰，周宇，劉溪，沈夏霜，羅永巨，甘西

(廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530021)

吉富羅非魚GIFT Oreochromis niloticus具有生長(zhǎng)快、規(guī)格齊、體形好、出肉率高、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是中國目前羅非魚養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種［1］。羅非魚雄魚的生長(zhǎng)速度比雌魚快40%～50%，在適宜的水溫下，雌性羅非魚每隔12～15 d可繁殖一次，很容易造成池塘養(yǎng)殖密度過大，影響成魚的規(guī)格和養(yǎng)殖效益［2］。因此，開展羅非魚性別控制研究，實(shí)現(xiàn)羅非魚苗種單性養(yǎng)殖具有重要的意義。

目前，羅非魚苗種性別人工調(diào)控的方法主要有種間雜交法［3］、激素投喂法［4］和超雄魚三系配套法［5］。種間雜交法主要是采用奧利亞羅非魚Oreochromis aureus作父本與尼羅羅非魚 Oreochromis niloticus作母本進(jìn)行雜交，后代理論上均是雄魚，但受親本純度和環(huán)境因素的影響，雜交后代的雄性率常在70%～95%，且其受精率、孵化率和雜交后代的均勻度均比自交苗低。激素投喂法是在羅非魚魚苗發(fā)育早期在餌料中添加一定劑量的雄性激素，使雌性魚苗發(fā)生性逆轉(zhuǎn)為雄魚的方法，因涉及到藥物殘留及食品質(zhì)量安全問題，越來越被引起關(guān)注。超雄魚三系配套法因受限于YY超雄魚的制種及分子鑒別技術(shù)，從而影響了其推廣［6］。通過改變孵化環(huán)境溫度來控制動(dòng)物的性別在研究爬行動(dòng)物方面已得到廣泛應(yīng)用，在水產(chǎn)動(dòng)物中對(duì)銀漢魚和牙鲆的研究也有相關(guān)報(bào)道［7-8］。因此，如果能通過改變孵化環(huán)境的溫度，提高羅非魚仔魚的雄性率將有望解決上述難題。本研究中，在前期開展溫度誘導(dǎo)吉富羅非魚性別比率研究的基礎(chǔ)上，對(duì)比了36℃水溫誘導(dǎo)與甲基睪酮激素投喂對(duì)吉富羅非魚魚苗雄性率和生長(zhǎng)發(fā)育的影響，旨在為吉富羅非魚苗種生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2012年5—10月在廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院國家級(jí)廣西南寧羅非魚良種場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)用親魚由國家級(jí)廣西南寧羅非魚良種場(chǎng)提供，在網(wǎng)箱中雌雄按1∶1配對(duì)，定期檢查雌魚口，如含受精卵時(shí)取出移至孵化箱進(jìn)行人工孵化，受精卵孵化至卵黃苗階段時(shí)運(yùn)回水族控溫實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)試驗(yàn)。

甲基睪酮藥物購自天津力生制藥股份有限公司，用酒精充分溶解后拌入餌料中投喂。

1.2 方法

1．2．1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將同一家系的受精卵隨機(jī)分成5組，分別記為 A、B、C、D、E(對(duì)照)，每組100粒，每組設(shè)3個(gè)平行。其中，A組為36℃高溫持續(xù)誘導(dǎo)10 d;B組為30℃下投喂甲基睪酮10 d;C組為30℃下投喂甲基睪酮20 d;D組為36℃溫度誘導(dǎo)+甲基睪酮投喂10 d，E組 (對(duì)照)為30℃正常組。比較不同處理方式對(duì)仔魚雄性率的影響。

1．2．2 水溫調(diào)控 試驗(yàn)用控溫系統(tǒng)為室內(nèi)循環(huán)流水式系統(tǒng)，能準(zhǔn)確控制溫度 (誤差為±0．1℃)。具體升溫過程及溫度誘導(dǎo)期間的日常投喂管理詳見朱佳杰等［9］的方法。

1．2．3 藥物投喂 將甲基睪酮 (MT)由顆粒狀先碾磨成粉狀，用體積分?jǐn)?shù)為98%的酒精充分溶解，再用純凈水稀釋摻入餌料 (50%鰻料+50%羅非魚粉料)中，將餌料中甲基睪酮的濃度調(diào)整到0．6 μg/g(餌料)，反復(fù)搓合餌料，使藥物均勻拌合在餌料中，室內(nèi)晾干后即可投喂。每天定時(shí)投喂4次(8:00、12:00、16:00、22:00)，投喂量以吃飽不剩為佳，投餌后半小時(shí)將剩余餌料吸出。

1．2．4 魚苗培育 試驗(yàn)結(jié)束后，將魚苗轉(zhuǎn)移至國家級(jí)廣西南寧羅非魚良種場(chǎng)的池塘中培育。魚苗均在同一個(gè)池塘不同編號(hào)的網(wǎng)箱中繼續(xù)培育120 d，網(wǎng)箱 (2．0 m×2．0 m×1．5 m)規(guī)格為9目，養(yǎng)殖至規(guī)格為50～60 g時(shí)，可通過體表生殖孔數(shù)量鑒定其性別。

1．2．5 性別比率檢測(cè)

(1)體表生殖孔觀察法。吉富羅非魚雌雄分辨主要通過觀察魚腹部的生殖孔數(shù)量，具體詳見李莉萍等［10］的方法。

(2)性腺組織切片檢測(cè)。在羅非魚規(guī)格較小時(shí)，通過生殖孔觀測(cè)其性別的準(zhǔn)確率較低，而取其性腺采用組織壓片法能準(zhǔn)確判斷它的性別，組織切片制作方法詳見陳興漢［11］的方法。

1．2．6 生長(zhǎng)速度測(cè)定 將誘導(dǎo)結(jié)束后每組魚苗的體質(zhì)量以及魚苗培養(yǎng)120 d后的體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出每組魚的生長(zhǎng)速度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件統(tǒng)計(jì)各組的平均雄性率、平均存活率及其標(biāo)準(zhǔn)差，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S．D．)表示。用SPSS 17．0軟件進(jìn)行單因素方差分析 (ANOVA)，用Duncan多重比較法檢驗(yàn)各組間幼魚存活率和雄性率的差異性，顯著性水平設(shè)為 0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對(duì)吉富羅非魚雄性率的影響

將試驗(yàn)組及對(duì)照組魚經(jīng)不同方式處理后的魚苗培育至60 g左右時(shí)，進(jìn)行雌雄性別鑒定。從表1可見，經(jīng)過36℃溫度誘導(dǎo)和在餌料中添加甲基睪酮均能顯著提高魚苗的雄性率。各組的雄性率大小依次為C組＞D組＞A組＞B組＞E組 (對(duì)照)，其中A、C、D組之間無顯著性差異 (P＞0．05)，但3個(gè)組均與B組和對(duì)照組有顯著性差異 (P＜0．05)。各組間的平均存活率無顯著性差異 (P＞0．05)。以上結(jié)果說明，36℃溫度誘導(dǎo)10 d的雄性率已接近投喂含甲基睪酮餌料20 d的效果。

表1 不同處理方式對(duì)吉富羅非魚魚苗雄性率及存活率的影響Tab.1 Effects of different treatments on survival and male rate of larval GIFT tilapia

2.2 不同處理方式對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)速度的影響

將溫度誘導(dǎo)及投喂甲基睪酮試驗(yàn)結(jié)束后的魚苗放在同一個(gè)池塘的不同網(wǎng)箱中養(yǎng)殖，每個(gè)組分別放在同一個(gè)網(wǎng)箱內(nèi)。經(jīng)過120 d的養(yǎng)殖，各組的試驗(yàn)終末體質(zhì)量及日均增重見表2。從表2可以看出，各組的平均日增重大小依次為C組＞D組＞A組＞B組＞E(對(duì)照)，其中C組的生長(zhǎng)速度最快，平均日增重達(dá)到了5．42 g/d，對(duì)照組的生長(zhǎng)速度最慢，平均日增重為4．69 g/d，除B組外，其他試驗(yàn)組平均日增重與對(duì)照組有顯著性差異 (P＜0．05)。

表2 不同處理方式對(duì)吉富羅非魚魚苗生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effects of different treatments on growth of the GIFT tilapia

2.3 溫度對(duì)吉富羅非魚性腺發(fā)育的影響

將不同方式處理后的魚苗轉(zhuǎn)到水溫為27～32℃的池塘網(wǎng)箱中養(yǎng)殖至性成熟，分別取雌雄魚的性腺組織做切片，觀察性腺的發(fā)育情況 (圖1)。結(jié)果顯示:溫度處理組 (36℃組和36℃+甲基睪酮組)的魚都得到了偏向于雄性的比率，精巢組織包含有較多精子 (圖1-B)，而對(duì)照組 (30℃)精巢還是精原細(xì)胞 (圖1-A);對(duì)溫度處理組的雌魚生殖孔檢查發(fā)現(xiàn)，大部分雌魚具有兩性特征，生殖孔閉合非常緊，無法正常排卵，解剖后發(fā)現(xiàn)，性腺組織中的卵母細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組少 (圖1-C、D)。初步推斷，可能是在性腺分化時(shí)期持續(xù)的高溫誘導(dǎo)破壞了垂體性腺軸的激素分泌，并抑制了生殖細(xì)胞的發(fā)育所致。

3 討論

圖1 吉富羅非魚發(fā)育成熟后性腺組織學(xué)橫切切片(100×)Fig.1 Transverse section of gonads in mature GIFT tilapia(100×)

羅非魚的性別決定機(jī)制很復(fù)雜，受到遺傳和環(huán)境因素的共同調(diào)控。已有研究表明，羅非魚的性別分化存在一個(gè)臨界敏感期，在性別分化開始之前或分化期給予一定的環(huán)境壓力刺激，則可以改變其群體的性別比率［12-13］。在餌料中添加雄性激素是已往提高羅非魚雄性率的常用方法，而通過改變孵化水溫來提高魚苗雄性率的方法，因其安全有效，已被大多數(shù)研究者所青睞。Baroiller等［14］、Desprez等［15］先后在對(duì)尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn)，通過提高孵化水溫能顯著提高群體的雄性比率，但不同品種羅非魚的臨界溫度是不一樣的。朱佳杰等［16］研究發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚的性腺分化屬于溫度依賴性決定類型，在胚胎發(fā)育早期，孵化水溫對(duì)其性別分化存在著很大的影響，在36℃水溫中連續(xù)誘導(dǎo)10 d能顯著提高魚苗的雄性率。本研究中，在前期研究不同溫度誘導(dǎo)吉富羅非魚雄性率的基礎(chǔ)上，比較了36℃水溫誘導(dǎo)和用甲基睪酮投喂不同時(shí)間時(shí)的雄性率效果。結(jié)果表明，36℃連續(xù)誘導(dǎo)10 d的雄性率與用甲基睪酮投喂20 d的效果相近，36℃水溫誘導(dǎo)并同時(shí)飼喂相同劑量的甲基睪酮得到的雄性率與36℃誘導(dǎo)的效果無顯著性差異。說明控制好誘導(dǎo)的水溫及處理時(shí)間確實(shí)能夠有效提高魚苗的雄性率，這與Baroiller等［14］研究溫度誘導(dǎo)尼羅羅非魚魚苗的雄性率結(jié)果相似。溫度誘導(dǎo)提高雄性率的主要機(jī)理是高溫誘導(dǎo)破壞了羅非魚性別分化的正常發(fā)育過程，通過提高環(huán)境溫度促使吉富羅非魚芳香化酶mRNA表達(dá)量降低，導(dǎo)致雌二醇分泌減少，從而導(dǎo)致性腺向雄性轉(zhuǎn)化［17］。

吉富羅非魚的生長(zhǎng)與雄性率存在緊密的關(guān)系。本研究中，對(duì)溫度誘導(dǎo)及用甲基睪酮處理后的魚苗生長(zhǎng)跟蹤發(fā)現(xiàn)，36℃處理10 d組的生長(zhǎng)速度要顯著優(yōu)于藥物處理組，且雌雄個(gè)體間的規(guī)格相對(duì)較均勻，這主要是高雄性率所致。對(duì)各組魚的性腺組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過36℃溫度誘導(dǎo)后，雌魚的性腺發(fā)育不完全，生殖孔緊閉不能夠排卵，屬于不育魚。這主要是在性腺分化關(guān)鍵時(shí)期持續(xù)高溫誘導(dǎo)后使性腺軸激素分泌失調(diào)，造成生殖細(xì)胞發(fā)育不完全所致。本研究中對(duì)比了溫度誘導(dǎo)及藥物處理對(duì)吉富羅非魚雄性率的影響，研究結(jié)果可為今后利用地源熱泵技術(shù)及太陽能技術(shù)調(diào)控孵化水溫，大規(guī)模生產(chǎn)高雄性率羅非魚商品苗種提供了技術(shù)支撐。但羅非魚有多個(gè)品種，不同品種間的性逆轉(zhuǎn)最佳敏感期及敏感溫度還有待進(jìn)一步研究。

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