劉衛(wèi)東，葉英響*，楊潔紅

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曲妥珠單抗對(duì)心肌細(xì)胞損害作用的實(shí)驗(yàn)研究

劉衛(wèi)東1，葉英響1*，楊潔紅2

目的 探討曲妥珠單抗對(duì)大鼠心功能的影響及其作用機(jī)制。方法50只6周齡SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)均分為觀察組和對(duì)照組。觀察組大鼠腹腔注射曲妥珠單抗，共計(jì)給藥7 d；對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水，體積與注射時(shí)間同觀察組。分別于給藥前后用心臟超聲檢查大鼠心功能變化；采用TUNEL技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3活性。結(jié)果給藥1周后，觀察組大鼠LVEDd、LVESd顯著擴(kuò)大，LVPWDd、LVPWSd明顯變薄，LVEF、LVFS顯著降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥1周后，觀察組凋亡指數(shù)(AI)顯著增加，Caspase-3活性顯著增強(qiáng)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論曲妥珠單抗會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損害，其機(jī)制可能與激活Caspase-3、促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

曲妥珠單克隆抗體；心功能；凋亡

0 引言

曲妥珠單抗(赫賽汀)是抗人體表皮生長(zhǎng)因子受體-2(Her-2)的單克隆抗體，其通過(guò)附著在Her-2上阻止人體表皮生長(zhǎng)因子在Her-2上的附著，從而阻斷癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。1998年FDA批準(zhǔn)曲妥珠單抗用于Her-2過(guò)度表達(dá)的乳腺癌治療，極大程度降低了乳腺癌的復(fù)發(fā)率和死亡率，目前曲妥珠單抗已經(jīng)成為乳腺癌治療的主要靶向治療藥物。然而在臨床應(yīng)用中關(guān)于曲妥珠單抗所致心臟不良反應(yīng)的報(bào)道較多，主要集中于導(dǎo)致患者左心室收縮功能降低。Morris等[1]報(bào)道，應(yīng)用曲妥珠單抗后，患者可能出現(xiàn)無(wú)癥狀心力衰竭或有癥狀心力衰竭等。也有報(bào)道，單一使用曲妥珠單抗引起心力衰竭的發(fā)生率約為2.5%～4.7%[2]，但是關(guān)于其具體作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究給予大鼠腹腔注射曲妥珠單抗，觀察其對(duì)大鼠心功能的影響，探討曲妥珠單抗所致心臟損害的可能作用機(jī)制，以期為臨床預(yù)防、治療提供參考，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 50只6周齡SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行稱重，大鼠體重(158.4±7.9)g。將50只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對(duì)照組，每組25只。兩組大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，控制室溫18～25 ℃。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法 觀察組大鼠腹腔注射曲妥珠單抗：曲妥珠單抗針(赫賽汀，440 mg/20 mL)稀釋至22 mg/mL，并于4 ℃保存；首次給藥劑量12 mg/mL，從第2天開(kāi)始劑量調(diào)整為6 mg/mL，連續(xù)注射7 d，總給藥量為48 mg/mL。對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水，體積與注射時(shí)間同觀察組；兩組大鼠注射量按照大鼠體重每3天調(diào)整1次。同時(shí)每日觀察大鼠活動(dòng)情況、飲食量、體重及皮毛色澤變化。

1.2.2 心功能檢測(cè) 分別于首次給藥前、最后1次給藥后腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，并將大鼠固定于操作臺(tái)上，用彩色多普勒超聲儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括：舒張末期左心室后壁厚度(LVPWDd)、舒張末期室間隔厚度(IVSDd)、收縮期左心室后壁厚度(LVPWSd)、收縮期室間隔厚度(IVSSd)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)、左心室舒張末期容量(EDV)、左心室收縮末期容量(ESV)，并計(jì)算各組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)。各指標(biāo)檢測(cè)5次，取平均值。

1.2.3 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 最后1次麻醉后，在冰臺(tái)上將大鼠左心室組織切取，部分用中性甲醛浸泡，剩余部分用液氮冷凍后于-80 ℃冰箱中保存待檢。取左心室3個(gè)不同部位做常規(guī)石蠟切片，采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)：將樣本TUNEL染色后，再于高倍鏡下對(duì)每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，記錄每個(gè)視野中總心肌細(xì)胞核數(shù)與凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)，其中凋亡指數(shù)(AI)=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)/總心肌細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.2.4 Caspase-3活性檢測(cè) 將心肌細(xì)胞裂解后，提取總蛋白。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞組織總蛋白濃度；再按照Caspase-3活性熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3活性；以標(biāo)準(zhǔn)誤濃度作為橫坐標(biāo)、吸光度(OD值)作為縱坐標(biāo)，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，再用蛋白濃度校正即得Caspase-3活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析或秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠心臟超聲檢查結(jié)果比較 兩組大鼠給藥前心功能各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥1周后，觀察組大鼠LVEDd、LVESd顯著擴(kuò)大，LVPWDd、LVPWSd明顯變薄，LVEF、LVFS顯著降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 兩組大鼠TUNEL染色、Caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果 給藥1周后，觀察組AI增加，Caspase-3活性增強(qiáng)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 兩組大鼠心臟超聲檢查結(jié)果比較

表2 兩組大鼠TUNEL染色、Caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果

3 討論

約有25%的乳腺癌患者的Her-2呈高表達(dá)。研究顯示，Her-2陽(yáng)性的乳腺癌具有高侵襲性，且預(yù)后較差，臨床治療難度較高[3]。曲妥珠單抗是1998年開(kāi)始由FDA批準(zhǔn)用于抗Her-2的靶向治療藥物，該藥顯著提高了Her-2陽(yáng)性乳腺癌患者的遠(yuǎn)期生存率和生活質(zhì)量。李偉等[4]單用曲妥珠單抗治療Her-2陽(yáng)性中晚期乳腺癌患者，其有效率、中位無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期顯著提高。Korkaya等[5]也證實(shí)，曲妥珠單抗聯(lián)合阿霉素、紫杉醇能夠顯著提高乳腺癌患者的完全緩解率。上述研究均提示，聯(lián)合曲妥珠單抗的一線化療方案能夠顯著提高抗腫瘤的效果。但是國(guó)內(nèi)外關(guān)于曲妥珠單抗用藥后誘導(dǎo)心功能損害的報(bào)道越來(lái)越多。Caussa等[6]發(fā)現(xiàn)，在采用曲妥珠單抗治療后，約有3%～9%的患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的心臟不良反應(yīng)。但是報(bào)道多見(jiàn)于臨床觀察。雖然Costantini等[7]對(duì)小鼠腹腔注射曲妥珠單抗后，發(fā)現(xiàn)小鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)病理性損害，但是其具體作用機(jī)制仍不清楚。因此，研究曲妥珠單抗所致心功能損害發(fā)病機(jī)制對(duì)降低藥物的不良反應(yīng)有著重要意義。

黃平等[8]分別對(duì)給予曲妥珠單抗化療前后的患者進(jìn)行心電圖檢查，結(jié)果顯示，化療6個(gè)月后，患者舒張期、收縮期左心室容積顯著增加，舒張末期和收縮末期左心室直徑顯著擴(kuò)大，左心室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率也明顯降低。本研究對(duì)健康大鼠分別腹腔注射曲妥珠單抗和生理鹽水，結(jié)果顯示，給藥1周后，觀察組大鼠LVEDd、LVESd顯著擴(kuò)大，LVPWDd、LVPWSd明顯變薄，LVEF、LVFS顯著降低，與給予曲妥珠單抗治療后患者的心功能表現(xiàn)基本相符。蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對(duì)心肌細(xì)胞也有損害作用，可導(dǎo)致Ⅰ型心肌損害[9]，這種損害是不可逆的。而Russell等[10]報(bào)道，曲妥珠單抗為Ⅱ型心肌損害，往往出現(xiàn)于用藥3個(gè)月后，這種心肌損害均為可逆性，一旦撤藥心肌功能會(huì)重新恢復(fù)。因此。在臨床中，需要區(qū)別對(duì)待曲妥珠單抗與蒽環(huán)類抗腫瘤藥物所致的心功能異常。

本研究顯示，與對(duì)照組相比，給藥1周后，觀察組AI顯著增加，Caspase-3活性顯著增強(qiáng)。Chen等[11]報(bào)道，心肌細(xì)胞凋亡會(huì)引起左心室舒張功能障礙，通過(guò)抑制心肌細(xì)胞的凋亡能夠改善心室重構(gòu)，表明曲妥珠單抗引起的心功能降低與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。Her-2作為酪氨酸激酶參與細(xì)胞的增殖、分化[12]。Posch等[13]研究顯示，Her-2能夠維持心肌細(xì)胞功能完整性，Her-2受體激活會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大或擴(kuò)張性心肌病。推測(cè)曲妥珠單抗所致心肌細(xì)胞凋亡與抑制Her-2受體有關(guān)。韓冬等[14]證實(shí)，Her-2受體受到抑制后，會(huì)促進(jìn)Bcl-xS表達(dá)，降低Bcl-xL表達(dá)，自動(dòng)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體功能異常，細(xì)胞正常能量代謝障礙，最終發(fā)展成心肌細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行基因，多種細(xì)胞凋亡途徑最終通過(guò)激活Caspase-3而實(shí)現(xiàn)。因此，筆者認(rèn)為，曲妥珠單抗會(huì)激活Caspase-3，進(jìn)而參與Her-2受體抑制過(guò)程，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。綜上所述，曲妥珠單抗會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損害，其機(jī)制可能與激活Caspase-3、促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。但是由于曲妥珠單抗所致心臟毒性機(jī)制較為復(fù)雜，且Caspase-3介導(dǎo)的凋亡途徑較多，因此其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

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Experimental study on the effect of trastuzumab on the damage of myocardial cells

LIU Wei-dong1,YE Ying-xiang1*,YANG Jie-hong2

(1.Department of Pharmacy,Yiwu Central Hospital,Yiwu 322000,China; 2.Basic Medical College of Zhejiang Chinese Medicine Univefrsity,Hangzhou 310053,China)

Objective To explore the effects and mechanism of trastuzumab on cardiac function of rats.Methods50 SD rats were randomly divided into observation group (n=25) and control group (n=25),rats in observation group were injected with trastuzumab for 7 d; rats in control group were intraperitoneally injected with physiological saline,with the same volume and injection time as observation group.The cardiac function was detected by cardiac ultrasonography before and after injection,TUNEL technique was used to determine the cell apoptosis,and the myocardial cell Caspase-3 activity was detected.ResultsThe LVEDd,LVESd of rats in observation group significantly expanded at 1 weeks after administration,and the LVPWDd,LVPWSd were significantly thinner,LVEF and LVFS significantly reduced,there were significant differences between the two groups (P<0.05).The apoptosis index of observation group increased,and the Caspase-3 activity enhanced(P<0.05).ConclusionTrastuzumab can lead to myocardial cell damage,and the mechanism may be related to the activation of Caspase-3 and promoting myocardial cell apoptosis.

Trastuzumab; Cardial function; Apoptosis

2014-10-27

1.浙江省義烏市中心醫(yī)院藥劑科，浙江 義烏322000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，杭州 310053

國(guó)家自然科學(xué)基金(81073139)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505008

*通信作者