任 凌

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rhBNP對(duì)慢性心力衰竭兔心功能的影響及機(jī)制

任 凌

目的 探討重組人腦利鈉肽(rhBNP)對(duì)慢性心力衰竭(HF)模型兔心功能的影響及可能的機(jī)制。方法以阿霉素誘導(dǎo)HF家兔模型(24只)，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組。連續(xù)治療4周后，測(cè)試左心功能，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中AngⅡ的含量，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)心?、瘛ⅱ笮湍z原的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果治療組左心室結(jié)構(gòu)和收縮功能各項(xiàng)指標(biāo)顯著優(yōu)于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組心?、?、Ⅲ型膠原含量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組血清中AngⅡ含量顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論rhBNP能抑制HF家兔心肌中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量表達(dá)，一定程度上能拮抗血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的活性，改善心室重塑，緩解HF癥狀。

心衰；家兔；rhBNP；左心功能；阿霉素；血管緊張素Ⅱ

0 引言

在心力衰竭(HF)的發(fā)生發(fā)展過程中，長時(shí)間的交感神經(jīng)系統(tǒng)及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，可引起心肌細(xì)胞的壞死及凋亡，造成心肌膠原過度沉積，導(dǎo)致患者的心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重塑，心肌間質(zhì)纖維化，影響心臟的舒張收縮功能，即心室重構(gòu)過程。目前已證明，心室重構(gòu)是引起慢性心衰惡化的重要原因之一[1]。BNP是心室肌細(xì)胞分泌的一種多肽，其作用和心鈉肽有類似之處，具有擴(kuò)張血管、排鈉排水的效應(yīng)。2001年8月美國食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了SCIOS公司生產(chǎn)的rhBNP上市，成為新一代靜脈注射用治療失代償性心力衰竭的藥物，但是rhBNP對(duì)慢性心力衰竭的療效至今尚不明確。本文主要研究rhBNP對(duì)家兔心功能改善的影響，分析HF與AngⅠ、AngⅡ及AngⅢ型膠原之間的關(guān)系，對(duì)試驗(yàn)中的家兔的心肌組織變化進(jìn)行觀察，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇24只健康白兔(體重2.4～3.0 kg)，隨機(jī)選擇8只作為對(duì)照組，其余16只予以建立模型。

1.2 方法

1.2.1 干預(yù)方法 用注射水將鹽酸阿霉素配制為2 mg/mL的注射液，對(duì)16只模型組家兔進(jìn)行腹腔注射，劑量約為4 mg/kg，每周1次，連續(xù)注射6周[2]，用心臟超聲檢測(cè)心臟情況。確認(rèn)模型制作成功后，隨機(jī)將16只模型家兔分為模型組(8只)和治療組(8只)。治療組家兔靜脈注射rhBNP 8 h，速度為0.03 μg/(kg·min)[3]，模型組接受與治療組相同體積的注射用水進(jìn)行腹腔靜脈注射。飼養(yǎng)4周后，將其麻醉，腹主動(dòng)脈處取血3～6 mL，靜置1 h。離心后取上清液，保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。取家兔心臟組織一部分，置于4%多聚甲醛中固定，用石蠟包埋，切片，HE染色；將其中一部分置于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 家兔心功能測(cè)定 心臟超聲檢查儀使用GE公司VIVID7，探頭頻率為4～8 MHz，深度為1.5～2 cm，將動(dòng)物麻醉后使用M型超聲測(cè)定收縮末期及舒張末期左心室內(nèi)徑(ESD、EDD)、室間隔及左室后壁厚度(IVsd、LVPWd)，應(yīng)用Teichho ltz公式計(jì)算每搏量(SV)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF%)及短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS%)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)心?、?、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá) 用Trizol試劑盒提取各組心肌細(xì)胞中的RNA，采用紫外分光光度法對(duì)各組提取出的RNA的純度和濃度進(jìn)行測(cè)定。取RNA 5 μg，將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，之后，以cDNA為模板，用TaqDNA聚合酶對(duì)PCR擴(kuò)增進(jìn)行催化。內(nèi)參β-Actin引物：(5′-3′) R：CCGACTCGTCATACTCCTGCTT，F(xiàn)：ATCGTGCGGACATCAAGG，475 bp為擴(kuò)增產(chǎn)物。預(yù)變性94 ℃ 5 min，進(jìn)入循環(huán)，94 ℃ 50 s，退火溫度分別為54、57 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，72 ℃延伸 8 min，共30個(gè)循環(huán)。在瓊脂糖凝膠中將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)拍攝的照片進(jìn)行吸光度掃描，以β-Actin參照校正，目的基因的相對(duì)表達(dá)含量取二者比值。

1.3 觀察指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中AngⅡ的含量，光鏡下觀察家兔心臟組織，總結(jié)家兔心臟組織的病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組家兔心功能檢查結(jié)果 見表1。

表1 兩組兔的心室結(jié)構(gòu)和收縮功能各項(xiàng)指標(biāo)比較

2.2 各組家兔心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)情況 見圖1、圖2。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定血清中AngⅡ結(jié)果 見圖3。

圖1 各組家兔心肌組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)結(jié)果

注：*與模型組比較，P<0.05

2.4 各組家兔心臟HE染色結(jié)果 見圖4。光鏡下觀察所見，對(duì)照組家兔的心肌細(xì)胞排列有序，橫紋、形態(tài)大小均正常，且細(xì)胞核在細(xì)胞一側(cè)，無明顯的病理改變。而模型組家兔的心肌組織細(xì)胞互相交錯(cuò)、排列紊亂，細(xì)胞無橫紋，且細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的固縮現(xiàn)象，異染色質(zhì)出現(xiàn)明顯的團(tuán)塊狀變化。治療組心肌組織改變介于二者之間。

3 討論

慢性心力衰竭的現(xiàn)代治療包括緩解臨床癥狀及延緩心力衰竭的發(fā)展，現(xiàn)已闡明心室重塑(Ventricular remodeling，VR)是導(dǎo)致慢性心力衰竭惡性循環(huán)的根本病因，現(xiàn)代心臟病防治中最受關(guān)注的難題即為如何干預(yù)心衰后VR。目前，BNP對(duì)心力衰竭治療的確切作用機(jī)制尚未完全清楚，認(rèn)為主要是與利鈉肽受體(NPR-A)結(jié)合，促進(jìn)鳥苷酸環(huán)化酶(cGMP)的合成，通過其介導(dǎo)的第二信使轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮其抗心衰的生物學(xué)效應(yīng)[4-6]。

VR主要表現(xiàn)為心臟成纖維細(xì)胞大量的合成，且分泌出大量的膠原纖維。心臟膠原蛋白分為5種。其中，Ⅰ型心肌膠原蛋白約占55%，雖然其回縮性較小，但抗拉能力較強(qiáng)，決定了心肌收縮舒張的僵硬程度；其次為Ⅲ型心肌膠原蛋白，約占總數(shù)的11%，其纖維較細(xì)，具有較好的彈性。如果Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量過高，會(huì)引起體內(nèi)重塑心肌膠原網(wǎng)，進(jìn)而使得心肌間質(zhì)纖維化，心肌活動(dòng)受到一定的抑制。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量過少，會(huì)使得心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)退化，甚至出現(xiàn)心肌過度擴(kuò)張而破裂，使得心肌彈性下降，抗?fàn)坷韵陆?，阻礙心肌收縮[7-9]。rhBNP是一種與人體內(nèi)BNP完全相同的內(nèi)源性激素物質(zhì)，其作用機(jī)制：①利尿作用，促進(jìn)鈉的排泄；②通過擴(kuò)張靜脈和動(dòng)脈，降低心臟的前后負(fù)荷；③神經(jīng)內(nèi)分泌作用，腎素-血管緊張素-醛固醇系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)得到有效抑制，阻滯急性心衰演變中的惡性循環(huán)[10]。

圖4 各組家兔心臟組織病理學(xué)比較(×200)

本研究結(jié)果顯示，模型組中的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組家兔在接受rhBNP治療后，mRNA表達(dá)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明rhBNP能夠明顯抑制Ⅰ、Ⅲ型心肌膠原的表達(dá)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)心肌間質(zhì)纖維化。同時(shí)，家兔血清中AngⅡ的表達(dá)越強(qiáng)，Ⅰ、Ⅲ型心肌膠原表達(dá)也越強(qiáng)[11]。rhBNP在心血管系統(tǒng)循環(huán)中，能夠?qū)ρ芫o張素Ⅱ產(chǎn)生一定的拮抗作用，松弛血管平滑肌細(xì)胞，擴(kuò)張外周靜脈血管；同時(shí)，促進(jìn)鈉排泄，這樣不僅減輕心臟負(fù)荷，還降低心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)，延緩心室重塑的發(fā)展，緩解HF病情[12]。綜上所述，rhBNP對(duì)于HF的治療安全、有效，值得臨床推廣。

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Effect and mechanism of rhBNP on cardiac function of heart failure rabbits

REN Ling

(The First People′s Hospital of Yibin,Yibin 644000,China)

Objective To observe the effect and explore the possible mechanism of rhBNP on cardiac function of heart failure rabbit model.MethodsHeart failure rabbit models (n=24) were induced by adriamycin.24 rabbits were randomly divided into control group,model group and treatment group.After 4 weeks treatment,the left heart function was tested,and the plasma angiotensin Ⅱ content was determined by ELISA,the mRNA expression in collagenⅠand collagen Ⅲ was detected by RT-PCR.ResultsThe indexes of left ventricular structure and systolic function in treatment group was significantly better than that of model group (P<0.05); The myocardial collagen Ⅰ and collagenⅢ content of model group was obviously higher than that of control group (P<0.05); Compared with model group,the expression of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ in treatment group decreased significantly (P<0.05); The serum Ang Ⅱ content in treatment group was significantly lower than that of model group (P<0.05).ConclusionrhBNP can inhibit the expression of collagenⅠand collagen Ⅲ in heart failure rabbits,antagonize the activity of angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) in a certain extent,and improve the ventricle remodeling.

Heart failure; Rabbit; rhBNP; Left heart function; Adriamycin; AngⅡ

2014-10-27

四川省宜賓市第一人民醫(yī)院，四川 宜賓 644000

四川省衛(wèi)生廳科學(xué)研究項(xiàng)目(100587)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505007