姚新武，張 霖，樊亞超

（中國(guó)石化撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇發(fā)酵工藝優(yōu)化研究

姚新武，張 霖，樊亞超

（中國(guó)石化撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

1,3-丙二醇是合成聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯的基礎(chǔ)原料，利用甘油進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的生物煉制技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。以克雷伯氏肺炎桿菌為出發(fā)菌種，對(duì)菌種保藏方式、發(fā)酵體系環(huán)境、氮?dú)馔獗?、pH中和劑以及甘油品質(zhì)等發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在較優(yōu)的工藝條件下，1,3-丙二醇產(chǎn)量可達(dá)103.38 g/L。

克雷伯氏肺炎桿菌；1,3-丙二醇；發(fā)酵工藝；優(yōu)化

1,3-丙二醇（1,3-PDO）可用于化妝品、液體清潔劑、防凍液、服裝、室內(nèi)裝飾材料、工程聚合物等諸多領(lǐng)域。作為一種含有雙功能團(tuán)的二醇，1,3-PDO最重要的應(yīng)用方向是與對(duì)苯二甲酸縮聚生成聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯（PTT）[1]。目前國(guó)際上1,3-PDO主要生產(chǎn)廠商有德國(guó)Degussa公司、荷蘭Shell公司和美國(guó)Du Pont公司，國(guó)內(nèi)1,3-PDO產(chǎn)量較少，主要依靠從國(guó)外進(jìn)口。

1,3-PDO的合成方法分為化學(xué)法和微生物法[2]，其中后者以甘油生物轉(zhuǎn)化法和葡萄糖生物轉(zhuǎn)化法最為常見(jiàn)。甘油是油脂工業(yè)的主要副產(chǎn)物，生物柴油技術(shù)的推廣將產(chǎn)生大量的廉價(jià)副產(chǎn)物甘油，因此開(kāi)發(fā)條件溫和、原料價(jià)廉易得的利用甘油進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO的生物煉制技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。目前雖然有大量關(guān)于1,3-PDO生產(chǎn)的研究，但少有研究關(guān)注利用甘油生產(chǎn)1,3-PDO的發(fā)酵工藝優(yōu)化。

本文以克雷伯氏肺炎桿菌（K. pheumoniae）為菌種，對(duì)以甘油為底物生產(chǎn)1,3-PDO的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌種

菌種為中國(guó)石化撫順石油化工研究院自主篩選的K. pheumoniae FY-5，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），編號(hào)為0798。

1.2 菌種的培養(yǎng)和發(fā)酵[3]

種子培養(yǎng)基：酵母粉 3.0 g/L、麥芽粉 3.0 g/L、蛋白胨 5.0 g/L和NaCl 5.0 g/L。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉 5.0 g/L、K2HPO4·3H2O 10.0 g/L、KH2PO42.0 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、FeCl3·6H2O 30 mg/L、CoCl2·6H2O 5 mg/L、維生素B125 mg/L和甘油 30.0 g/L。

在含有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角搖瓶中接種K. pheumoniae FY-5，37 ℃和140 r/min搖床培養(yǎng)10 h。

以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入到1 L發(fā)酵罐中進(jìn)行批次發(fā)酵，培養(yǎng)基為基本發(fā)酵培養(yǎng)基，工作體積為0.7 L，發(fā)酵過(guò)程pH維持在7.0，發(fā)酵溫度為37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min。

在15 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，培養(yǎng)基為基本發(fā)酵培養(yǎng)基，工作體積為7 L，發(fā)酵過(guò)程中將甘油濃度控制在10～40 g/L，發(fā)酵過(guò)程pH維持在7.0，發(fā)酵溫度為37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min。

1.3 分析方法

甘油、1,3-PDO用HPLC檢測(cè)（Dionex配Bio-Rad HPX-87H色譜柱柱），檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，流動(dòng)相為0.005 mol/L的H2SO4溶液，流速0.8 mL/min，柱溫65 ℃，具體檢測(cè)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

生物量（BIOMASS）采用752型分光光度計(jì)測(cè)定菌體在600 nm處吸光度（OD600），再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程將吸光度值轉(zhuǎn)化成生物量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種保藏方式對(duì)1,3-PDO合成的影響

用 NaOH作 pH中和劑，氮?dú)馔獗葹?0.4 m3/(m3·min)（又可稱0.4 vvm），分別從凍干保藏菌種和液體保藏菌種出發(fā)，通過(guò)48 h發(fā)酵實(shí)驗(yàn)考察菌種保藏方式對(duì)1,3-PDO合成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 菌種保藏方式對(duì)1,3-PDO合成影響Table 1 Effect of strain preservation methods on 1,3-PDO synthesis

從表1可以看出，凍干保藏菌種的1,3-PDO產(chǎn)量、生產(chǎn)速率和生物量分別高于液體保藏菌種20.69%、19.42%和5.25%。這是由于菌種經(jīng)過(guò)凍干保藏處理后可以將突變可能性降至較低水平[5]，菌種經(jīng)長(zhǎng)期保藏后再?gòu)?fù)蘇活化，其體內(nèi)代謝酶系和代謝通量仍能與保藏前相當(dāng)，進(jìn)而使凍干保藏菌種能夠表現(xiàn)出較強(qiáng)的發(fā)酵性能。

2.2 發(fā)酵體系環(huán)境對(duì)1,3-PDO合成的影響

用NaOH作pH中和劑，以凍干保藏菌種為出發(fā)菌種，分別在空氣通氣比0.2 vvm、不通氣和氮?dú)馔獗?.2 vvm條件下發(fā)酵48 h考察好氧環(huán)境、微氧環(huán)境和厭氧環(huán)境對(duì)1,3-PDO合成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，3種發(fā)酵體系環(huán)境下1,3-PDO產(chǎn)量和生產(chǎn)速率排序?yàn)椋旱獨(dú)馔獗?.2 vvm＞不通氣＞空氣通氣比0.2 vvm。這是由于菌種的甘油代謝途徑包括氧化和還原兩個(gè)途徑，厭氧環(huán)境有利于氧化途徑產(chǎn)生的還原力 NADH2進(jìn)入還原途徑以供給1,3-PDO的合成[6]。此外，還原途徑中的甘油脫水酶（GDHt）是菌種代謝的關(guān)鍵限速酶[7]，氧的存在會(huì)導(dǎo)致GDHt失活進(jìn)而抑制菌種合成1,3-PDO[8]。

表2 發(fā)酵體系環(huán)境對(duì)1,3-PDO合成影響Table 2 Effect of fermentation system environment on 1,3-PDO synthesis

2.3 氮?dú)馔獗葘?duì)1,3-PDO合成的影響

用NaOH作pH中和劑，以凍干保藏菌種為出發(fā)菌種，分別在氮?dú)馔獗?.2 vvm、0.4 vvm和0.6 vvm 條件下發(fā)酵 48 h考察不同氮?dú)馔獗葘?duì)1,3-PDO合成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 氮?dú)馔獗葘?duì)1,3-PDO合成影響Table 3 Effect of nitrogen ventilation ratio on 1,3-PDO synthesis

從表3可以看出，菌種的各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)隨氮?dú)馔獗鹊脑黾映尸F(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)獨(dú)馔獗葹?.4 vvm時(shí)，1,3-PDO產(chǎn)量、生產(chǎn)速率和生物量達(dá)到最高水平。

2.4 pH中和劑種類對(duì)1,3-PDO合成的影響

用Ca(OH)2作pH中和劑，以凍干保藏菌種為出發(fā)菌種，分別在不通氣、氮?dú)馔獗?.2 vvm和氮?dú)馔獗?.4 vvm條件下發(fā)酵48 h考察Ca(OH)2對(duì)1,3-PDO合成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 Ca(OH)2對(duì)1,3-PDO合成影響Table 4 Effect of Ca(OH)2on 1,3-PDO synthesis

從表4可以看出，與NaOH作為pH中和劑相比（見(jiàn)表 2），在相同條件下，使用Ca(OH)2作pH中和劑時(shí)菌種的發(fā)酵水平有顯著提高，最高1,3-PDO產(chǎn)量和生產(chǎn)速率分別為103.38 g/L和2.15 g/(L·h)。究其原因，一方面是由于Ca2+能改善細(xì)胞膜的通透性[9]，進(jìn)而提高了底物和產(chǎn)物的跨膜運(yùn)輸效率；另一方面是由于Ca2+能有效地沉淀發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的 CO2，促使脫羧反應(yīng)朝正向進(jìn)行，期間生成的還原力提高了菌種代謝的還原途徑通量，進(jìn)而提高了菌種發(fā)酵水平。

分別使用NaOH和Ca(OH)2作pH中和劑時(shí)，發(fā)酵液電導(dǎo)率隨時(shí)間變化趨勢(shì)如圖1所示。

圖1 發(fā)酵液電導(dǎo)率隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.1 Changing trend of electrical conductivity of fermentation broth with time

從圖1可以看出，發(fā)酵液電導(dǎo)率隨時(shí)間呈現(xiàn)出先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，使用NaOH作為pH中和劑時(shí)發(fā)酵液的電導(dǎo)率始終高于Ca(OH)2，終止發(fā)酵時(shí)，使用NaOH作為pH中和劑的發(fā)酵液電導(dǎo)率為20.12 mS，比Ca(OH)2的15.11 mS高出33.16%，說(shuō)明使用NaOH作為pH中和劑時(shí)發(fā)酵液的離子強(qiáng)度和滲透壓較高，而過(guò)高的離子強(qiáng)度和滲透壓將導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡[10]，不利于菌種的生長(zhǎng)和代謝。此外，從后續(xù)分離提純角度考慮，鈣離子比鈉離子更易從發(fā)酵液體系中除去[11]。

2.5 甘油品質(zhì)對(duì)1,3-PDO合成的影響

為考察菌種的原料適應(yīng)性，本文選取了兩種甘油作為原料。精甘油為北京化工廠生產(chǎn)，化學(xué)純。粗甘油為生物柴油副產(chǎn)物，其組成為：甘油含量84.71%、甲醇含量0.74%、甘油單甲醚含量0.0061%、甘油二甲醚含量0.021%，其余為水。

分別以精甘油和粗甘油作為發(fā)酵底物，以凍干保藏菌種為出發(fā)菌種，在氮?dú)馔獗?.4 vvm條件下，分別用NaOH和Ca(OH)2作pH中和劑，發(fā)酵48 h考察甘油品質(zhì)對(duì)1,3-PDO合成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 甘油品質(zhì)對(duì)1,3-PDO合成影響Table 5 Effect of glycerol quality on 1,3-PDO synthesis

從表5可以看出，使用NaOH和Ca(OH)2作pH中和劑，以粗甘油作為發(fā)酵底物時(shí)菌種的1,3-PDO產(chǎn)量相比于精甘油分別下降了6.99%和29.44%。這是由于粗甘油中存在的生物柴油酯類、機(jī)械雜質(zhì)以及其他雜質(zhì)對(duì)菌種的生長(zhǎng)和代謝具有一定抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致菌種的發(fā)酵水平出現(xiàn)下降。這也意味著菌種的原料適應(yīng)性不強(qiáng)，在使用粗甘油作為發(fā)酵底物前，應(yīng)對(duì)其中雜質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)預(yù)處理。

3 結(jié) 論

（1）以凍干形式保藏的菌種具有良好活性，在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了較優(yōu)的發(fā)酵性能。

（2）厭氧發(fā)酵環(huán)境有利于菌種合成1,3-PDO，當(dāng)?shù)獨(dú)馔獗葹?.4 vvm時(shí)1,3-PDO產(chǎn)量最高。

（3）使用Ca(OH)2作為pH中和劑時(shí)，發(fā)酵48 h菌種的1,3-PDO產(chǎn)量最高可達(dá)103.36 g/L。

（4）為滿足菌種的原料適應(yīng)性，生物柴油副產(chǎn)物粗甘油需進(jìn)行預(yù)處理，將其中抑制菌種生長(zhǎng)和代謝的雜質(zhì)去除后，使其更加適用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO。

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Optimization of Fermentation Process for Producing 1,3-PDO From Glycerol

YAO Xin-wu, ZHANG Lin, FAN Ya-chao
(Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals, SINOPEC, Liaoning Fushun 113001, China)

1,3-PDO is the basic raw material to produce polytrimethylene terephthalate. Biorefinery technology of producing 1,3-PDO from glycerol with ferment has broad application prospect. In this paper, K. pneumoniae was chosen as the starting strain. Fermentation process parameters including strain preservation methods, fermentation system environment, nitrogen ventilation ratio, pH neutralizing agent and glycerol quality were optimized. The experimental results show that the yield of 1,3-PDO can reach to 103.38 g/L under optimum process conditions.

Klebsiella pheumoniae; 1,3-PDO; Fermentation process; Optimization

TQ 923

A

1671-0460（2015）08-1813-03

中國(guó)石油化工集團(tuán)公司資助項(xiàng)目，項(xiàng)目號(hào)SH1112。

2015-06-27

姚新武（1986-），男，黑龍江大慶人，助理工程師，碩士，2012年畢業(yè)于北京化工大學(xué)微生物與生化藥學(xué)專業(yè)，研究方向：生物基化學(xué)品研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：yaoxinwu.fshy@sinopec.com, 電話：024-56389324。