易運紅,張敏娟,呂君亮,張丹虹,吳功慶，*

(1.廣東藥學(xué)院 醫(yī)藥化工學(xué)院,廣東中山 528458；2.鄭州工業(yè)貿(mào)易學(xué)校基礎(chǔ)部,河南鄭州 450007)

?

茶與葡萄皮總多酚的提取、純化及抗氧化活性

易運紅1,張敏娟2,呂君亮1,張丹虹1,吳功慶1，*

(1.廣東藥學(xué)院 醫(yī)藥化工學(xué)院,廣東中山 528458；2.鄭州工業(yè)貿(mào)易學(xué)?；A(chǔ)部,河南鄭州 450007)

本研究以烏龍茶與葡萄皮為研究對象,在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用 Box-Behnken實驗設(shè)計以及響應(yīng)面分析對乙醇浸提烏龍茶與葡萄皮總多酚的工藝進行優(yōu)化,再以NKA9型大孔樹脂純化,測定純化多酚的還原力以及羥自由基清除率,評價其抗氧化活性強弱。結(jié)果表明:總多酚提取最佳工藝條件為溫度88℃,乙醇濃度48%,液料比22∶1(mL/g),時間40min,總多酚的得率可達4.76%,理論預(yù)測為4.79%,相差0.62%,響應(yīng)面優(yōu)化的回歸方程有一定實踐指導(dǎo)意義。NKA9型大孔樹脂純化精制后多酚含量由25.54%提高至82.19%。以抗壞血酸作對照,測定精制多酚的還原能力和羥自由基消除能力,精制烏龍茶與葡萄皮總多酚的還原力和羥自由基消除能力均優(yōu)于同濃度的抗壞血酸,總多酚對·OH的消除率達50%時的濃度IC50為17.60μg/mL,抗氧化活性較好。

烏龍茶,葡萄皮,總多酚,響應(yīng)面分析法,抗氧化

茶多酚是一種天然無毒的抗氧化劑,具有高效的抗氧化、抗衰老、抗癌、抗輻射、防治心血管疾病和捕集體內(nèi)游離基等功效,在醫(yī)藥保健品、食品、日用化工品等方面有著廣泛的應(yīng)用[1-4]。我國是茶葉生產(chǎn)大國,資源豐富,只有少量茶葉加工成高檔商品茶,大量的中低檔茶、下腳料、粗老葉被廢棄,故開發(fā)茶葉新用途,對保護環(huán)境、節(jié)約能源和創(chuàng)造經(jīng)濟價值都有很大意義[5]。有研究表明,在眾多植物多酚中,以葡萄多酚清除自由基能力最強,其顯著的抗氧化能力為VE的50倍,VC的20倍左右[6],葡萄多酚還呈有防冠心病、防癌抗癌、抗疲勞、抗炎、抗突變、降血清膽固醇等生物活性[7-8],但目前所研究使用的葡萄多酚多從葡萄籽中提取。我國釀酒葡萄廢棄物葡萄皮大部分是作為肥料、飼料或燒材,利用率很低。葡萄酒皮渣數(shù)量可觀,又具葡萄清香、多酚含量豐富[9],結(jié)合兩者開發(fā)多酚產(chǎn)品,有一定的特色。并有研究表明,不同的天然抗氧劑抗氧化活性有協(xié)同增效作用[10-11]。茶多酚、葡萄多酚都不是單一物質(zhì),是多酚類及其衍生物的混合物,由于茶多酚和葡萄多酚均為多酚類物質(zhì),結(jié)構(gòu)上的相似性,使得他們的理化性質(zhì)也具有相似性,為了簡化提取步驟,節(jié)省后續(xù)純化的成本,本研究采用低檔茶葉和釀酒葡萄皮渣同步提取多酚,響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝,大孔樹脂純化總多酚,測定精制總多酚的抗氧化活性,為以后進一步綜合利用茶葉和葡萄皮渣提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉為市場購買的包裝烏龍茶 產(chǎn)地福建安溪；葡萄皮渣 大澤山尹家葡萄酒廠；焦性沒食子酸 中國藥品生物制品檢定所；硫酸亞鐵、大孔樹脂NKA9 上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸 天津市百世化工有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、過氧化氫 天津市福晨化學(xué)試劑廠;酒石酸鉀鈉 天津市百世化工有限公司；其他試劑均為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。所有試劑均為分析純。實驗過程用水均為實驗室自制蒸餾水。

XMT-7000型數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；B220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；UV1102型紫外可見分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總多酚含量測定 采用酒石酸亞鐵法顯色可見分光光度法測定多酚含量,主要測定步驟參照文獻[12],具體如下:準確吸取25、50、75、100、125mg/mL五種不同濃度的標準溶液1mL,加水4mL,酒石酸亞鐵溶液5mL,置于一系列25mL的容量瓶中,用pH7.5的磷酸緩沖液定容。用水代替沒食子酸作為對比,在540nm處測定吸光度(A)。所測的吸光度y與對應(yīng)的沒食子酸濃度x繪制標準曲線回歸方程為:y=14.54x+0.0133,R2=0.997(R2>0.99),0～0.08mg/mL的范圍內(nèi)與吸光度呈線性相關(guān)。樣品多酚以茶葉、葡萄皮(質(zhì)量比1∶1)提取,含量測定方法同上,根據(jù)標準曲線算出樣品的多酚含量。

1.2.2 總多酚的提取 總多酚提取的單因素實驗:分別以乙醇體積分數(shù)(v/v,40%、50%、60%、70%、80%、90%)、浸提溫度(70、75、80、85、90℃)、浸提時間(30、35、40、45、50min)、液料比(5∶1、11∶1、17∶1、23∶1、29∶1)等4 個因素作單因素實驗,考察各因素對多酚提取量的影響,同一實驗重復(fù)3次。

響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件:根據(jù)Box-Behnken原理,綜合單因素實驗結(jié)果,以總多酚提取量(Y)為響應(yīng)值,通過響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化提取條件。選取影響多酚提取量的4個因素乙醇濃度(A)、浸提時間(B)、浸提溫度(C)、液料比(D)為自變量,采用四因素三水平共29個實驗點的響應(yīng)面分析實驗。同一實驗重復(fù)3次。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table1 The response surface test factors and levels

1.2.3 大孔樹脂純化總多酚 大孔樹脂純化參照文獻[13]稍作改動,具體如下:精密稱取10g預(yù)處理好的NKA9型大孔樹脂,裝入1.8cm×30cm的層析柱中,上樣液體積為60.00mL,上樣液多酚濃度為3.04mg/mL,洗脫流速為4.00mL/min,洗脫劑乙醇的濃度為60%。將純化后的洗脫液與乙酸乙酯按照1∶1的比例混合,攪拌40min,靜置40min,分液,取上層液體蒸發(fā)溶劑,60℃干燥至恒重。純化精制后多酚含量由25.54%提高至82.19%,密封備用。

1.2.4 總多酚的抗氧化活性測定 烏龍茶與葡萄皮總多酚溶液的配制:精確稱取精制粉末0.05g,用60%乙醇配制得到濃度分別為20.14、40.28、60.42、80.56、100.70、201.39、302.09μg/mL的烏龍茶與葡萄皮總多酚溶液。同法配制抗壞血酸溶液。以下實驗采用該系列溶液。

還原力的測定:還原能力的測試參照文獻[14],具體如下:分別精密吸取1.00mL以上濃度的烏龍茶與葡萄皮總多酚溶液置10mL的具塞比色管中,依次精密加入2.5mL磷酸鹽緩沖液(pH6.6,0.2mol/L)及2.50mL質(zhì)量分數(shù)為1%的K3Fe(CN)6溶液,于50℃的水浴中反應(yīng)20min后冰浴冷卻,并精密加入2.50mL質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液,以3000r/min離心10min后精密移取上清液5.00mL,并精密加入4.00mL蒸餾水及1.00mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的FeCl3溶液,混合均勻,于10min(以加入0.1%的FeCl3溶液0.5mL時開始計時)后,以蒸餾水調(diào)零,以1cm比色皿在波長700nm處測定吸光度,反應(yīng)物的吸光度越大表示還原力越強,同一實驗重復(fù)3次。

抗壞血酸溶液還原力測定步驟同上。

羥基自由基清除能力:羥基自由基消除實驗參照文獻[15]并稍作改動,具體步驟如下:在10mL的具塞比色管中分別精密加入2.00mL濃度不同的烏龍茶與葡萄皮總多酚溶液,再依次精密加入6mmol/L FeSO4溶液2.00mL,6mmol/L水楊酸溶液2.00mL,最后加入6mmol/L H2O2溶液2.00mL啟動反應(yīng),搖勻,置37℃的水浴中反應(yīng)30min。以蒸餾水調(diào)零,以1cm比色皿在波長510.0nm處測定吸光度Ai,用水代替水楊酸時測得某樣品濃度下的光密度Aj,用水代替抗氧化劑時測得空白對照光密度A0。同一實驗重復(fù)3次。

抗壞血酸溶液羥基自由基消除能力測定步驟同上。

清除率按下式計算:清除率(%)=(1-(Ai-Aj)/A0)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003 統(tǒng)計分析,結(jié)果用“平均值±標準差”表示,響應(yīng)面結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總多酚提取的單因素實驗結(jié)果

2.1.1 浸提時間對得率的影響 由圖1可知,液料比15∶1,60%乙醇溶液浸提溫度75℃條件下,隨著提取時間從30min增長至40min,多酚得率從3.82%增加至4.89%,當提取時間超過40min,得率反而下降,隨著浸提時間的增長,多酚長時間處于高溫下造成部分氧化,使得浸出量下降[16]。因此最佳浸提時間應(yīng)設(shè)定在40min左右。

圖1 浸提時間對得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on yield of polyphenols

2.1.2 料液比對得率的影響 由圖2可知,60%乙醇溶液在浸提溫度75℃條件下水浴30min,隨著液料比的增大,多酚提取率也增加至4.01%,當液料比達到23∶1(mL/g)之后,再增大料液比提取率又減少到3.84%。植物多酚易與植物組織中的蛋白質(zhì)、生物堿、多糖、花色苷等物質(zhì)結(jié)合,這種結(jié)合阻礙了多酚的浸提,而有機溶劑是結(jié)合反應(yīng)的有效抑制劑。有機溶劑與水的混合液可打斷多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)的結(jié)合鍵,有利于多酚的浸提[17]。料液比的增加會造成浸提液的用量增加,增大了多酚類物質(zhì)與空氣的接觸面積,使得其氧化,致使提取率下降,同時料液比過大也會造成溶劑和能源的浪費,并給后續(xù)工作帶來困難[18]。綜合考慮提取率、溶劑用量、后處理,選擇液料比23∶1(mL/g)左右為佳。

圖2 液料比對得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of polyphenols

2.1.3 乙醇濃度對得率的影響 多酚在植物體內(nèi)通常與蛋白質(zhì)、多糖以氫鍵和疏水鍵形式形成穩(wěn)定的化合物,而醇羥基具有氫鍵斷裂能力,有利于使結(jié)合態(tài)存在的多酚類物質(zhì)游離出來,因此,復(fù)合體系更有利于原料中多酚的提取[19-20]。本實驗選擇乙醇與水的混合體系作為提取溶劑,不同體積分數(shù)的乙醇溶液對多酚類物質(zhì)得率的影響如圖3所示。在其他因素不變的情況下,剛開始隨著乙醇濃度的增加,得率也增加,當乙醇濃度達到50%時,提取率最大4.23%,再增加乙醇的濃度,得率反而下降至2.54%,因為高濃度的乙醇會引起多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的沉淀,導(dǎo)致多酚和這些大分子物質(zhì)共同沉淀,因此浸出量反而降低[21]。因此,50%乙醇是多酚提取的最佳溶劑。

圖3 乙醇濃度對得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of polyphenols

2.1.4 浸提溫度對得率的影響 由圖4可知,溫度升高,提取率增大,因為溫度升高,分子熱運動增加,加速了溶質(zhì)向溶劑的擴散速率；因?qū)嶒灄l件限制以及溫度過高引起乙醇揮發(fā)迅速等原因,從提取率和節(jié)約能源兩方面考慮,提取溫度90℃為宜。

圖4 溫度對得率的影響Fig.4 Effect of temperature on yield of polyphenols

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。表3對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化軟件方差分析數(shù)據(jù)表Table3 Analytical data of results of response surface optimization

根據(jù)表3可分析得出,模型的p值<0.0001,表明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義；方差分析的結(jié)果表明,A,B,C,D,CD,BC,A2,B2,C2,D2都是模型的顯著因素,四個因素對多酚提取率的影響大小依次為D>A>C>B。失擬差p>0.05,表明方程模型失擬不顯著,擬合效果較好,可用回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。多元擬合回歸方程為:

提取率=4.71-0.15A+0.096B-0.14C+0.17D-0.23A2-0.51B2-0.22C-0.23C2+0.20CD-0.16D2

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Experimental results of response surface optimization

續(xù)表

由回歸方程得出的最優(yōu)條件為乙醇濃度48.57%,浸提時間40.49min,浸提溫度88.31℃,液料比21.91∶1(mL/g),最大預(yù)測得率應(yīng)為4.79%。

2.2.2 最佳工藝條件的預(yù)測和檢驗 為方便實際操作,將工藝參數(shù)修訂為乙醇濃度48%,浸提時間 40min,浸提溫度 88℃,液料比22∶1(mL/g)。在此條件下進行驗證實驗,得率實驗值為4.76%,相對誤差為0.62%,與預(yù)測值接近,說明此實驗結(jié)果較為可靠,模型是有效的。

2.3 烏龍茶與葡萄皮總多酚抗氧化活性的測定結(jié)果

2.3.1 還原力的測定結(jié)果 如圖5所示,隨著濃度的增加,吸光值也在逐漸增大,在實驗濃度范圍內(nèi),相同濃度下,多酚的還原能力明顯強于抗壞血酸。馬宇平等[22]研究表明,當濃度為50、100、200μg/mL時,葡萄皮多酚的還原力吸光值分別為0.15、0.22、0.37；顏棟美等[23]研究表明,當濃度為50、100、200μg/mL時,茶多酚的還原力吸光值分別為0.20、0.41、0.70。本實驗結(jié)果表明,當濃度為20、40、80μg/mL時,總多酚的還原力吸光值分別為0.56、0.72、0.78,在一定濃度范圍內(nèi),總多酚的還原力明顯優(yōu)于同濃度的上述葡萄多酚或茶多酚的還原能力?？赡苁瞧咸讯喾优c茶多酚存在協(xié)同作用而增強了還原力。

圖5 還原能力Fig.5 Reduction ability

2.3.2 羥基自由基清除率測定的結(jié)果 由圖6得知,抗壞血酸對·OH的抑制率達50%時的濃度IC50為134.22μg/mL遠遠大于總多酚IC5017.60μg/mL,故羥基自由基的清除能力抗壞血酸小于總多酚,隨著濃度的提高,兩者的清除率均在增大。杜曉等[24]報道,炒青葉茶多酚對·OH的抑制率達50%時的濃度(IC50)為90.00mg/L；謝貞建等[25]研究得出,普洱茶提取物的IC50為31.13μg/mL,綠茶提取物的IC50為49.36μg/mL；孫靜濤等[26]研究發(fā)現(xiàn),葡萄皮渣多酚消除羥自由基IC50為380μg/mL。本實驗總多酚IC5017.60μg/mL,優(yōu)于葡萄皮多酚或茶多酚?？赡苁遣瓒喾优c其它抗氧化劑存在協(xié)同抗氧化作用,協(xié)同作用的機理是通過基于氧化還原電位差的偶聯(lián)氧化[27]。

圖6 對羥基自由基的清除Fig.6 Scavenging rate of hydroxyl radical

3 結(jié)論

乙醇水浴輔助提取總多酚,通過單因素實驗和響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的提取多酚的最佳工藝條件為乙醇濃度48%,浸提時間40min,浸提溫度88℃,液料比22∶1(mL/g)的恒溫水浴提取2次,得率可達4.76%,與預(yù)測值之間的相對偏差較小,證明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝科學(xué)合理,具有一定的實用意義。

烏龍茶與葡萄皮總多酚的體外抗氧化活性研究表明,總多酚具有較強的自由基清除力及還原能力,在一定濃度范圍內(nèi),其抗氧化能力大于抗壞血酸。至于將分別提取的多酚混合,抗氧化活性會怎樣變化,不同來源的多酚如何發(fā)揮協(xié)同作用等,將有待進一步研究。

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Extraction,purification and antioxidant activity of total polyphenols from tea and grape skin

YI Yun-hong1,ZHANG Min-juan2,LV Jun-liang1,ZHANG Dan-hong1,WU Gong-qing1,*

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guangdong Pharmaceutical University,Zhongshan 528458,China；2.Fundamentals Department of Zhengzhou Trade and Industry School,Zhengzhou 450007,China)

This study used oolong tea and grape skins as the research object. On the basic of single factor experiment,the extraction conditions of polyphenols from tea and grape skin were optimized by response surface methodology(RSM). Under the condition of liquid to solid ratio of 22∶1(mL/g),ethanol concentration of 48%(v/v)as solvent,at the temperature of 88℃,extraction time of 40min,the average extraction yield of polyphenols was 4.76%,compared to the theoretical value,the relative error of 0.62%. Optimized by response surface regression equation had some practical significance.After purification by NKA9 type macroporous resin,polyphenol content increased from 25.54% to 82.19%. The antioxidant activities of the purified polyphenols and VCwere evaluatedinvitroby hydroxyl free radical elimination ability and reducing power,respectively. The results showed that the hydroxyl free radical elimination ability and reducing power of the purify polyphenols are better than that of the same concentration of VC.The total polyphenols had ·OH elimination rate of 50%(IC50)when the concentration of total polyphenols 17.60μg/mL. The results showed that the total polyphenols can be used as a source of potential antioxidant.

oolong tea;grape skin;polyphenols;response surface methodogy;antioxidant activity

2014-08-20

易運紅(1979-)，碩士，實驗師，主要從事中藥化學(xué)和有機化學(xué)的教學(xué)與研究。

TS209

B

:1002-0306(2015)09-0229-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.041

*通訊作者:吳功慶(1979-)，博士，實驗師，主要從事生物化學(xué)的研究。