閆倩云,李玲玲,叢方地，*,劉海臣,周學永,邢克智,孔新月,趙 瑞

(1.天津農學院基礎科學學院,天津 300384；2.內蒙古民族大學生命科學學院,內蒙古通遼 028042)

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固定化脂肪酶生物反應器催化合成乙酸正己酯

閆倩云1,李玲玲1,叢方地1，*,劉海臣2,周學永1,邢克智1,孔新月1,趙 瑞1

(1.天津農學院基礎科學學院,天津 300384；2.內蒙古民族大學生命科學學院,內蒙古通遼 028042)

為提高非水相酶促合成食品添加劑乙酸正己酯的效率,以羧甲基纖維素為穩(wěn)定劑,通過物理吸附,將假單胞菌脂肪酶Pseudomonascepacialipase固定在錐形瓶內壁上,制備成簡易的生物反應器,并研究了其用于催化合成乙酸正己酯的動力學。結果表明,在反應器中,加入己醇與乙酸乙烯酯的混合液,并在37℃、150r/min下搖動,反應即開始；反應液倒出,則反應停止,無需過濾。反應7h,相對于酶粉,反應器中的固定化酶,可使反應轉化率提高7倍,48h后,轉化率達99%。經10次循環(huán)催化、共10d與有機相的接觸,仍保留有52%的轉酯活性；同樣條件下,不添加羧甲基纖維素的固定化酶,僅有12.8%的活性?？梢?這種反應器操作方便,能有效提高酶的非水活性和穩(wěn)定性,適于催化非水相反應。

乙酸正己酯,假單胞菌脂肪酶,固定酶生物反應器,非水相

低分子量的脂類具有濃郁的水果香味,是食品行業(yè)常用的食用香精,如,乙酸正己酯具有香蕉香味,可用于飲料、甜點和烘烤食品中[1]。乙酸正己酯的傳統(tǒng)工業(yè)生產采用化學催化劑,如濃硫酸、金屬鹽、超強酸等,在較高溫度下催化合成,但是通常會有副產物,并不可避免地造成環(huán)境污染[2-4]。因而,環(huán)境友好的生物催化方法,特別是非水相酶催化合成,更受到人們青睞。如,超臨界條件下的脂肪酶酶催化、固定化脂肪酶酶催化轉酯、吸水劑輔助固定化脂肪酶酶催化等[5-7]。在近乎無水的非水相中的酶催化反應,不但反應條件溫和,而且副反應減少,非常有利于催化在水相中不穩(wěn)定的底物分子[8-9]。脂肪酶的催化特性是界面催化作用,即在水/油(有機相)上,表現出優(yōu)異的催化作用,但在有機相中催化活性明顯降低,且活性的穩(wěn)定性差[10-11]。因為脂肪酶的活性部位通常被一段α-螺旋覆蓋,被稱為蓋子結構[12]。在界面上,脂肪酶一方面可以被水相優(yōu)化,保持優(yōu)勢蛋白構象；另一方面蓋子被有機相打開,使之具有較好的催化活性,即所謂的界面活化機制[13]。在純有機相中,酶蛋白通常會被有機溶劑變性而失活,因而活性偏低、且不穩(wěn)定[11]。所以,提高非水相酶促合成乙酸正己酯的效率,應模擬脂肪酶的界面活化機制,提高酶的催化活性。為此,我們在已有研究的基礎上[5-6,14],以羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose,CMC)為穩(wěn)定劑,通過物理吸附,將脂肪酶Pseudomonascepacialipase(PCL)固定在錐形瓶內壁上,形成一種簡易的生物反應器,并用于催化己醇與乙酸乙烯酯的轉酯反應,收到了較好的催化效果。

表1 底物體積比對轉化率的影響Table1 Effect of substrate volume ratio on conversion

表2 反應液體積對轉化率的影響Table2 Effect of reaction solution volume on conversion

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PCL酶粉 購于日本天野制藥株式會社(33U/mg)；CMC 由施瑞客(天津)生物技術有限公司提供；正己醇、乙酸乙烯酯及其他試劑 皆為分析純。

固定化操作和催化反應所用儀器為恒溫搖床 HZQ-X,哈爾濱;動力學分析儀器為氣相色譜儀 儀盟 A90,上海;配有氫火焰檢測器和毛細管柱(SE-30 30m×0.32mm×0.33μm)。

1.2 PCL生物反應器的制備方法

參考以前的研究[15-16],選擇PCL作為轉酯催化劑。為實驗方便,選用10mL的錐形瓶作為固定化容器。加入10mg的酶粉和0.2mL的水(或0.05%的CMC水溶液),在搖床中,固定化條件為:敞口、37℃、150r/min、10h,恰好可以使酶均勻地吸附在錐形瓶的內壁上,形成簡易的固定化PCL酶生物反應器。

1.3 反應器催化轉酯及活化方法

固定化PCL酶生物反應器中,加入一定體積的正己醇與乙酸乙烯酯的混合物,蓋磨口塞并用封口膜密封,在搖床中,在37℃和150r/min的條件下催化反應。反應液一旦倒出反應器,反應即刻停止,反應液無需過濾,即可用于分析。反應器用少量石油醚沖洗后,可繼續(xù)用于下次催化反應。多次使用后的反應器,經石油醚洗滌后,再加入0.2mL水,重復前述固定化方法,可使衰減的酶活性重新恢復。

1.4 轉酯動力學分析方法

反應器中,轉酯反應一段時間后的反應液,取出20μL,用0.5mL的正己烷稀釋,用于氣相色譜(Gas chromatography,GC)分析。如果是酶粉催化,用0.25μm的濾膜過濾,取出20μL,用0.5mL的正己烷稀釋,用于氣相色譜分析。氣相色譜條件,氮氣為載氣(0.4MPa,分流比20∶1)。分析程序:135℃保留1min,以50℃/min升溫到200℃,并保留2min。進樣和檢測溫度分別為280℃和300℃。底物的轉化率,通過比較正己醇和乙酸正己酯的峰面積得出[17]。

2 結果與討論

2.1 PCL生物反應器與反應體系

因為酶是蛋白質,具有親水性,因此酶在玻璃壁上吸附牢固,用于催化反應時,在150r/min的條件下,搖動的有機相不能將酶從瓶壁上剝落,優(yōu)于酶在非極性載體上的固定化,酶與非極性載體結合不夠牢固,容易在使用中脫落[14]；當然,這種反應器不適于催化水相反應。反應底物為正己醇,在PCL酶催化下,與?；噭┮宜嵋蚁マD酯生成乙酸正己酯,同時生成的乙烯醇自發(fā)異構為乙醛,借此拉動反應不可逆地進行[5]。該無溶劑非水反應體系,沒有水的參與和生成,所以不必考慮溶液pH影響。反應后減壓蒸餾,即可除去剩余的乙酸乙烯酯和乙醛,得產物。使用10mg 的PCL酶粉,首先催化2mL反應液反應12h,根據轉化率,并考慮到盡可能地減少?；噭┑挠昧?確定正己醇和乙酸乙烯酯的體積比為1∶1(表1)。然后,在這個比例下,改變它們的用量,根據轉化率,并考慮到盡可能地提高酶催化反應液的體積,確定反應液中正己醇和乙酸乙烯酯的體積皆為1.5mL(表2)。同時,從轉化率可以看出酶粉的活性較低(表1)。

2.2 PCL固定化中水的作用

根據脂肪酶的界面活性和已報到的研究,可知酶的活性與其構象密切相關,而酶構象與其結合的必需水分子的數量相關[14,17-18]。進一步的研究揭示,必需水分子的作用是維持酶蛋白的正確構象,以激活酶[19]。以此為依據,我們以少量水為溶劑,通過固定化操作,將10mg PCL吸附在錐形瓶內壁上,多余的水分經揮發(fā)除去。結果表明,在反應前期,酶生物反應器中的PCL催化反應7h,底物轉化率為39.9%,相對于酶粉催化反應底物轉化率5.4%,提高了7倍多；生物反應器催化反應48h,轉化率≥99%,而酶粉催化反應的轉化率<20%(圖1)。從氣相色譜圖可以看到,兩種形式酶的活性差別顯著,7h后,PCL生物反應器中,2.23min處的產物乙酸正己酯的峰較大,而酶粉催化的反應體系中,產物峰不明顯(圖2)。如果將酶從器壁上小心地刮掉,用于催化反應,酶的活性類似于固定化酶；或者向使用多次、活性衰減的固定化酶中,加入少量水,重復固定化操作,酶的非水活性可以重新激活。這說明,酶激活,主要是水的修飾作用。固定化時,水的作用類似于界面上水相的作用,優(yōu)化了酶的構象；用于催化時,反應液相當于界面上的有機相的作用,酶活性部位上的蓋子被打開,表現出較高的催化活性[13]。即酶生物反應器催化非水反應,相當于分步模擬了脂肪酶的界面活性。然而,由于不存在水油界面,這種模擬,卻難于長期保持其催化活性,這種固定化PCL,在催化24h后,再次催化時,從底物的轉化率來看,催化活性降低幅度較大,催化轉酯反應的轉化率平均每次降低8.3%,10次催化、共10d與有機相的接觸,催化活性僅為最初的12.8%(最后一次催化底物轉化率11.1%與首次催化底物轉化率的比率86.6%)(圖 3)。原因是,酶長時間與有機相的接觸,酶必要的水分子被有機相帶走,而被變性,失去優(yōu)勢構象,因而活性降低[11]。顯然,要維系酶的活性,就要進一步穩(wěn)定酶的優(yōu)勢構象。

表3 CMC濃度對轉化率的影響(催化反應時間24h)Table3 Effect of CMC concentration on conversion(reaction catalyzed for 24h)

圖1 PCL酶粉與水修飾固定化PCL的催化動力學Fig.1 Kinetics of transesterification catalyzed by native and water-modified immobilized PCL

圖2 PCL酶粉與水修飾PCL催化反應體系的GC(7h) Fig.2 GC analysis on reaction mixture catalyzed by water-modified and native PCL after 7 h注：a.正己醇1.94min；b.乙酸正己酯2.23min。

圖3 水修飾PCL催化轉酯反應轉化率(24h/次)Fig.3 Conversions of reactions catalyzed by water-modified immobilized PCL for 24h each time

2.3 CMC對PCL活性的穩(wěn)定化

從蛋白質涂層微晶研究得到啟示,可以使用水性大分子穩(wěn)定PCL構象[20]?；贑MC的水溶性和大分子結構[21],CMC被選作穩(wěn)定劑,用于穩(wěn)定PCL的優(yōu)勢構象,延長其催化活性。經實驗發(fā)現,CMC濃度過低不足以維持酶的構象,濃度過高會阻礙底物分子進入活性部位,0.2mL 0.05% CMC的溶液適合固定化使用(表3)。在固定化時,用0.2mL 0.05% CMC 溶液代替同體積的水,用于固定化PCL,則得CMC穩(wěn)定化的PCL酶生物反應器。與單純使用水固定化相比,CMC穩(wěn)定化的PCL固定化酶的催化反應動力學與之相近,即活性相近(圖4)。但是CMC使酶在有機相中的穩(wěn)定性明顯升高,24h的催化后,再次催化時,酶催化活性的衰減明顯降低,催化反應轉化率平均每次降低4.7%,10次催化、共10d與有機相的接觸,催化活性仍保留最初的52%(最后一次催化底物轉化率46.0%與首次催化底物轉化率的比率88.6%)(圖5)。氣相色譜圖顯示,每次催化24h,第10次催化后,僅用水修飾的PCL催化轉酯合成乙酸正己酯的色譜峰較弱,而CMC穩(wěn)定的PCL催化轉酯合成乙酸正己酯的色譜峰依然較強(圖6)?？梢?相對于僅使用水固定化,CMC穩(wěn)定化的PCL酶生物反應器,其催化作用的穩(wěn)定性明顯升高；同樣,多次使用后,酶活性也可通過加入0.2mL水,重復固定化操作,使之恢復。這種酶生物反應器制備方便,操作簡便,催化活性和穩(wěn)定性不亞于報道的固定化酶[22]。相對于酶在非極性材料上的固定化[14,23],這種CMC穩(wěn)定的固定化酶更為穩(wěn)定；從界面活化機理的角度來看[13],這種酶固定化及其在非水相中的應用,是對脂肪酶界面活性的分步模擬,第一步通過固定化以水分子優(yōu)化和CMC穩(wěn)定化酶的構象,第二步依靠反應相的疏水作用打開酶活性部位上的蓋子,激活酶；可見,制備的固定化脂肪酶生物反應器具有更大的應用潛力。

圖4 CMC穩(wěn)定與水修飾固定化PCL的催化動力學Fig.4 Kinetics of transesterification catalyzed by CMC-stabilized and water-modified immobilized PCL

圖5 CMC穩(wěn)定PCL催化轉酯反應轉化率(24h/次)Fig.5 Conversions of reactions catalyzed by CMC-stablized immobilized PCLfor 24h each time

3 結論

固定化脂肪酶PCL生物反應器,制備方便,操作便利,酶與反應液的分離,只需將液體倒出即可,無需過濾。反應器中酶的活性相對于酶粉,從底物的轉化率來看,反應初期7h后,轉化率提高了7倍。而且,因CMC的存在,酶對有機相的耐受性增強,活性穩(wěn)定。催化48h后,轉化率達到99%,產物容易分離提純。本文的研究為乙酸正己酯的生物合成提供了一種綠色、簡易,而又有效的途徑；今后,穩(wěn)定脂肪酶構象方法和分子機制的研究,還需要深入,進一步推進乙酸正己酯的生物工業(yè)技術生產進程。

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Catalyzed synthesis of hexyl acetate in immobilized lipase bioreactor

YAN Qian-yun1,LI Ling-ling1,CONG Fang-di1,*,LIU Hai-chen2,ZHOU Xue-yong1,XING Ke-zhi1,KONG Xin-yue1,ZHAO Rui1

(1.College of Basic Science,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China;2.College of Life Sciences,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao 028042,China)

To efficiently improve lipase-catalyzed synthesis of food additive hexyl acetate in nonaqueous phase,a simple bioreactor was prepared by immobilizingPseudomonascepacialipase on inner wall of conical flask via physical adsorption and with carboxymethyl cellulose as stabilizer,and used in catalyzed synthesis of hexyl acetate. Results showed that the reaction began after hexanol and vinyl acetate added in this reactor at 37℃ and 150r/min,and the reaction stopped once reaction mixture powered off it. Comparing with lipase power,the immobilized lipase in bioreactor could cause 7-fold increase in transesterification conversion rate of hexanol reacting with vinyl acetate after 7h. After 48h,the conversion achieved more than 99%. Moreover,stability of lipase also was obviously strengthened for CMC-stabilized immobilization. After ten times of catalyzed recycles,total ten days of contacting with organic phase,CMC-stabilized immobilized lipase still kept 52% of transesterification activity. And under the same of conditions,water-modified immobilized lipase only left 12.8% of transesterification activity. It was obvious that the reactor was not only easy in operation but also available in enhancement of enzymatic activity and stability,fitting in nonaqueous catalysis.

Hexyl acetate;Pseudomonascepacialipase;immobilized enzyme bioreactornonaqueous phase;nonaqueous phase

2014-07-24

閆倩云(1991-)，女，學士，從事生物制藥方向的研究。

*通訊作者:叢方地(1968-)，男，博士，副教授，從事生物催化方向的研究。

天津市國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310061017)；國家自然科學基金項目(31070478)。

TS202.3

A

:1002-0306(2015)09-0171-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.029