王 雪，池玥蘭，華 春，汪振炯，吳雨龍，江海濤，周 峰，王仁雷

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046；2.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇南京 211171；3.江蘇第二師范學(xué)院生物系，江蘇南京 210013)

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不同提取方法對(duì)蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的特性研究

王 雪1，2，池玥蘭1，2，華 春2，汪振炯2，吳雨龍2，江海濤2，周 峰2，王仁雷3，*

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046；2.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇南京 211171；3.江蘇第二師范學(xué)院生物系，江蘇南京 210013)

以廢棄的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基基質(zhì)為原料,利用水提法、酶解法、超聲波法、超聲波-酶法、微波法和微波-酶法來(lái)提取蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖,研究不同提取方法下蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖得率、多糖黏度及多糖抗氧化活性的區(qū)別來(lái)比較六種提取工藝的優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)果表明:超聲波-酶法所得蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的得率最高,達(dá)30.27%,水提法最差,為10.69%。不同提取方法所得的多糖溶液黏度均隨多糖溶液濃度的增大而增大,在相同濃度下多糖溶液的表觀黏度大小依次為水提法>微波法>酶法>微波-酶法>超聲波法>超聲波-酶法。超聲波-酶法提取的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖體外抗氧化活性最好,而水提法的多糖抗氧化活性最差。

蛹蟲(chóng)草,培養(yǎng)基,多糖,得率,黏度,抗氧化活性

蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)又名北冬蟲(chóng)夏草,是著名的具有食藥用價(jià)值的食療菌種[1]。多糖作為蛹蟲(chóng)草的主要功效成分之一,具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫、降血糖、抗炎等多種藥理作用[2]。蛹蟲(chóng)草可以人工栽培,但栽培過(guò)程中有大量富含菌絲體的廢棄培養(yǎng)基被白白丟棄,造成寶貴資源浪費(fèi)。研究表明,蟲(chóng)草多糖是蛹蟲(chóng)草菌絲體內(nèi)中含量最多的藥理活性物質(zhì)[3],因此從蛹蟲(chóng)草廢棄培養(yǎng)基中提取蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖,并研究該多糖的生理活性,可以實(shí)現(xiàn)廢物利用并提高蛹蟲(chóng)草人工栽培的附加值[4]。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的提取報(bào)道,多集中于水提法,亦有微波法、超聲波法、酶法等不同方法輔助提取[5-8],在研究中發(fā)現(xiàn),不同的提取手段具有各自的優(yōu)缺點(diǎn),并且對(duì)多糖的活性影響各不相同。因此,本實(shí)驗(yàn)采用了水提法、酶解法、超聲波法、超聲波-酶法、微波法以及微波-酶法等不同提取方法提取了蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖,并探討了不同提取方法對(duì)蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的得率、黏度以及體外抗氧化活性的影響,同時(shí)較全面的比較各種方法的優(yōu)缺點(diǎn),旨在為進(jìn)一步改進(jìn)蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的提取工藝提供相應(yīng)參考,也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖奠定相應(yīng)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

培養(yǎng)過(guò)蛹蟲(chóng)草的大米培養(yǎng)基脫脂粉末 海安泓壽生物技術(shù)有限公司;纖維素酶(酶比活力50000U/g) 江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;無(wú)水乙醇(AR)、硫酸(AR)、苯酚(AR)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,AR)、七水合硫酸亞鐵(AR)、三氯甲烷(AR)、正丁醇(AR),水楊酸(AR)、雙氧水(AR)、鹽酸(AR)、鄰苯三酚(AR)、鐵氰化鉀(AR)、三氯乙酸(AR)、三氯化鐵(AR) 均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Centrifuge 5810R冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;SHZ-111型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;PHC-3C型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;格蘭仕微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器有限公司;MixMax型渦旋振蕩器 合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-3000 上海亞榮生化儀器廠;全自動(dòng)運(yùn)動(dòng)粘度測(cè)定儀YT-265Z 上海羽通儀器儀表廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲(chóng)草基質(zhì)粗多糖溶液的制備

1.2.1.1 水提法提取 稱(chēng)取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,在80℃下浸提2h,抽濾過(guò)濾得上清液,濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過(guò)夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復(fù)溶得蛹蟲(chóng)草基質(zhì)粗多糖溶液A。

1.2.1.2 超聲波法提取 稱(chēng)取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,超聲波提取(360W,50℃)50min,抽濾過(guò)濾得上清液,濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過(guò)夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復(fù)溶得蟲(chóng)草基質(zhì)粗多糖溶液B。

1.2.1.3 超聲波-酶法提取 稱(chēng)取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,調(diào)節(jié)pH至6.0,加纖維素酶酶解50min[9],之后超聲波提取(360W,50℃)50min,抽濾過(guò)濾得上清液,濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過(guò)夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復(fù)溶得蟲(chóng)草基質(zhì)粗多糖溶液C。

1.2.1.4 微波法提取 稱(chēng)取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,微波(480W)提取4min,抽濾過(guò)濾得上清液,濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過(guò)夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復(fù)溶得蛹蟲(chóng)草基質(zhì)粗多糖溶液D。

1.2.1.5 微波-酶法提取 稱(chēng)取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,調(diào)節(jié)pH至6.0,加纖維素酶酶解50min,之后微波提取4min,抽濾過(guò)濾得上清液,濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過(guò)夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復(fù)溶得蟲(chóng)草基質(zhì)粗多糖溶液E。

1.2.1.6 酶解法提取 稱(chēng)取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,調(diào)節(jié)pH至6.0,加纖維素酶酶解3h(60℃),之后100℃滅酶10min,冷卻,抽濾過(guò)濾得上清液,濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過(guò)夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復(fù)溶得蟲(chóng)草基質(zhì)粗多糖溶液F。

1.2.2 蛹蟲(chóng)草基質(zhì)精多糖的制備

1.2.2.1 脫色 向粗多糖液中加入1%(w/v)活性炭,75℃恒溫振蕩2.5h[10],再離心(4200r/min,10min)、棄沉淀。

1.2.2.2 脫蛋白 脫色后的多糖加Sevage液,萃取25min[11]。離心(3800r/min,10min),取最上層清液,重復(fù)上述操作至紫外掃描檢測(cè)在280nm處無(wú)明顯吸收,表明其中的蛋白類(lèi)雜質(zhì)已除盡。再向其中加4倍無(wú)水乙醇,放入冰箱靜置4h,取出離心(4200r/min,10min),棄去上清液,干燥沉淀即為精多糖。

1.2.3 蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖含量測(cè)定及得率計(jì)算 采用苯酚-硫酸法[12]測(cè)定蛹蟲(chóng)草多糖含量。多糖得率的計(jì)算方法如下:多糖得率以1g干品中提取出來(lái)的多糖總量的百分含量表示,計(jì)算公式如下:蟲(chóng)草基質(zhì)多糖得率(%)=多糖的質(zhì)量/培養(yǎng)基基質(zhì)樣品干物質(zhì)的質(zhì)量×100[7]

1.2.4 多糖黏度的測(cè)定 分別配制濃度為0.5、1.0mg/mL的多糖溶液,用LVDV-II+型Brookfield粘度儀(帶ULA附件)測(cè)試其黏度。

1.2.5 蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖體外抗氧化性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 配制0.2mmol/L DPPH自由基溶液,DPPH自由基與乙醇溶液混合后在517nm處有紫色基團(tuán)特征吸收峰。將蛹蟲(chóng)草多糖提取液按照一定濃度梯度(0.1、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL)稀釋,用蒸餾水調(diào)零。實(shí)驗(yàn)分為樣品組(樣品+DPPH),對(duì)照組(樣品+無(wú)水乙醇)和空白組(DPPH+無(wú)水乙醇)。加入蛹蟲(chóng)草多糖樣品和DPPH自由基溶液后,用渦旋振蕩器進(jìn)行混勻,避光反應(yīng)40min,在517nm處測(cè)其吸光值。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率:DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100。

表1 不同提取方法下蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖得率比較Table1 The extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides by different extraction methods

1.2.5.2 羥基自由基清除實(shí)驗(yàn) 采用Fenton反應(yīng)體系測(cè)定蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖對(duì)·OH的抑制作用[13]。于10mL試管中依次加入2mL FeSO4溶液(6mmol/L)、2mL不同濃度的粗多糖(0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL)的樣品溶液、2mL H2O2(6mmol/L)溶液,充分搖勻,靜置10min。再加入6mmol/L的水楊酸溶液2mL,充分搖勻,靜置30min,在510nm處測(cè)定其吸光度值,計(jì)算清除率。

清除率計(jì)算公式:

式中:A0為空白對(duì)照液的吸光度;Aλ為加入樣品溶液的吸光度；Aλ0為H2O代替H2O2測(cè)得的待測(cè)液的本底吸收。

1.2.5.3 超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn) 采用鄰苯三酚自氧化的方法測(cè)定。取4.5mL Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L),調(diào)pH至8.2,20℃水浴預(yù)熱20min,分別加入1mL不同(0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL)濃度的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖溶液,再加入0.4mL鄰苯三酚溶液(25mmol/L),混勻,25℃水浴5min后加入1mL的鹽酸溶液(8mmol/L)終止反應(yīng),在波長(zhǎng)229nm處測(cè)定吸光度,并計(jì)算清除率。

清除率計(jì)算公式:

清除率(%)=(A0-A)/A0×100

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；A為加入多糖溶液的吸光度。

1.2.5.4 還原力測(cè)定 采用Oyaizu[14]的方法進(jìn)行測(cè)定。取1mL不同(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg/mL)濃度的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖溶液,然后分別加入5mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L,pH6.6)和5mL鐵氰化鉀溶液(1%),置于50℃水浴20min,然后加入2mL的三氯乙酸(10%),搖勻,離心,取上清液2mL加入2mL蒸餾水和0.4mL三氯化鐵溶液(0.1%),混合均勻,室溫下反應(yīng)10min后在波長(zhǎng)700nm處測(cè)定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法下蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖得率比較

由表1可知,在相同提取時(shí)間內(nèi),超聲波-酶法的得率最高,達(dá)到30.27%,約為水提法的2.8倍。單獨(dú)超聲波法及微波法的得率均高于水提法得率。該原因可以歸結(jié)為超聲波和微波有助于破壞蛹蟲(chóng)草菌絲體的細(xì)胞壁,利于物料有效成分流出[7],因而多糖的得率較高。此外,添加纖維素酶之后,對(duì)多糖的得率均有一定提高。這可能因?yàn)榧?xì)胞壁的主要組成成分是果膠和纖維素類(lèi)物質(zhì),而纖維素酶能酶解細(xì)胞壁,在外力作用下,更有利于胞內(nèi)多糖的溶出[15],因此超聲波-酶法和微波-酶法及單獨(dú)纖維素酶法的得率均高于相應(yīng)對(duì)照。

2.2 多糖溶液黏度的比較

不同提取方法所得的多糖溶液黏度如圖1所示,由圖1可知,6種方法提取的多糖黏度均隨多糖溶液濃度的增大而增大。在多糖濃度相同時(shí),多糖溶液的黏度從高到低依次為:水提法>微波法>酶法>微波-酶法>超聲波法>超聲波-酶法。表觀黏度取決于聚合物相對(duì)分子質(zhì)量的大小、分子間的聚集和相互作用,據(jù)滕利榮[16]的研究表明,分子粘度與其分子量大小成正比關(guān)系,所以水提多糖分子量較大,可能因?yàn)樗岱▽?duì)多糖分子糖苷鍵破壞較少。而酶提法、超聲法及微波法所得多糖溶液黏度較小,表明其分子量較小,可能因?yàn)槊阜?、微波法和超聲法在破壞蛹蟲(chóng)草基質(zhì)細(xì)胞壁的同時(shí)使糖苷鍵斷裂,所以得到分子量較小的多糖。此外,經(jīng)超聲波處理后多糖的分子量下降更加顯著,且超聲波結(jié)合酶法提取對(duì)多糖的降解作用更加顯著,原因可以歸結(jié)于超聲波處理對(duì)多糖分子的糖苷鍵破壞更加嚴(yán)重。

圖1 不同方法所得蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的黏度比較Fig.1 The viscosity of Cordyceps militaris polysaccharides by different extraction methods

2.3 不同提取方法下蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖抗氧化性比較

2.3.1 DPPH自由基清除能力 從圖2可知,各種提取方法下得到的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖DPPH自由基清除能力均隨糖濃度的增大而升高。超聲波-酶法的DPPH自由基清除率最強(qiáng),最高達(dá)到93.51%。六種方法提取的多糖的DPPH自由基清除能力從高到低依次為:超聲波-酶法>超聲波法>微波-酶法>酶法>微波法>水提法。這可能是因?yàn)槊敢?、超聲波、微波?duì)蟲(chóng)草大分子多糖有一定降解作用,使其溶解度增加,更多活性基團(tuán)暴露,容易捕獲DPPH自由基。

圖2 不同提取方法下蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖DPPH自由基清除能力比較Fig.2 DPPH radical scavenging activity of Cordyceps militaris polysaccharides by different extraction methods

2.3.2 羥基自由基清除能力 如圖3所示,超聲波-酶法對(duì)羥基自由基清除能力最強(qiáng),水提法和微波法提取的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的清除率較低且接近。同時(shí),不同提取方法的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖對(duì)羥基自由基清除能力均隨多糖濃度的升高而增大。

圖3 不同提取方法下蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的羥基自由基清除率比較Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of Cordyceps militaris polysaccharides by different extraction methods

2.3.3 超氧陰離子自由基清除能力 由圖4可知,水提法提取的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖清除超氧陰離子能力最低,而超聲波-酶法提取的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖清除超氧陰離子能力最高,在多糖濃度為2mg/mL時(shí),清除率達(dá)到92.13%。多糖濃度在0.4mg/mL以后,各種方法提取的多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力上升趨勢(shì)變大。

圖4 不同提取方法下蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖清除超氧陰離子能力比較Fig.4 Comparative analysis of different extraction methods Cordyceps militaris polysaccharide matrix superoxide anion capacity

2.3.4 總還原力測(cè)定 據(jù)圖5得知,不同提取方法的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的總還原力差別較大,由圖可得,蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的還原力隨著多糖濃度的增加而增強(qiáng)。水提法以及微波法的總還原能力最低,超聲波-酶提法所得多糖的總還原力最高,當(dāng)多糖濃度為2.0mg/mL時(shí),其總還原力高達(dá)0.306,是水提多糖的1.45倍,超聲法所得多糖的總還原力次之,為0.281。而水提法所得多糖的總還原力最低。

圖5 不同提取方法下蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖還原能力比較Fig.5 The reducing power of Cordyceps militaris polysaccharides by different extraction methods

綜上所述,不同提取方法所得的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖抗氧化性均隨濃度的增加而增大,超聲波-酶法提取的多糖抗氧化活性最高,而微波-酶法提取時(shí)間最短,但抗氧化性一般。有研究表明超聲波-酶法提取的小分子量多糖較多,從而提高多糖的抗氧化性。水提法多糖抗氧化活性均為最低。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用水提法、酶解法、超聲波法、超聲波-酶法、微波法和微波-酶法六種提取方法提取蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖,其中超聲波-酶法所得蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的得率最高、黏度最低、抗氧化活性也最強(qiáng),且不同的提取方法提取的多糖活性不同。通過(guò)對(duì)六種蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖提取方法的比較,可為以后的蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的提取利用提供一定的依據(jù)。

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Effect of different extraction methods on the feature of polysaccharide inCordycepsMilitaris

WANG Xue1,2,CHI Yue-lan1,2,HUA Chun2,WANG Zhen-jiong2,WU Yu-long2,JIANG Hai-tao2,ZHOU Feng2,WANG Ren-lei3,*

(1.College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Nanjing 210046,China;2.School of Biochemical and Environmental Engineering,Nanjing Xiaozhuang College,Nanjing 211171,China;3.biology Department,Jiangsu Second Normal University,Nanjing 210013,China)

Six different extraction methods,including water extraction,enzymatic extraction,ultrasonic method,ultrasonic-enzymatic method,microwave method and microwave-enzyme method,were used to extractCordycepspolysaccharide fromCordycepsmilitarisculture medium. The extraction yield,viscosity and the impact of antioxidation were evaluated to compare the advantage and disadvantage of different extraction methods. The results showed that polysaccharide prepared by ultrasonic-enzymatic extraction showed the highest extraction yield 30.27%,while that of water extraction showed the lowest yield 10.69% at the same time. Polysaccharide viscosity with the increase of polysaccharide solution concentration by different extraction methods,the apparent viscosity at the same concentration was:water extraction>microwave extraction>enzyme extraction>microwave-enzymatic extraction>ultrasonic extraction>ultrasonic-enzymatic extraction. The polysaccharide prepared by ultrasonic-enzymatic extraction exhibited the strongest antioxidant activity,while that of water extraction showed the lowest antioxidant activity.

Cordycepsmilitaris;medium;polysaccharides;extraction rate;viscosity;antioxidant activity

2014-08-06

王雪(1988-)，女，研究生，研究方向：生物資源開(kāi)發(fā)與利用。

*通訊作者:王仁雷(1963-)，男，博士，教授，研究方向：功能性生物大分子、植物生物化學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21376112)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA021701)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131344)；2013年江蘇省人大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201311460012Z)；南京曉莊學(xué)院?？蒲许?xiàng)目(2012NXY08)。

TS201.2

A

:1002-0306(2015)09-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.001