唐美君， 殷坤山， 郭華偉， 肖 強(qiáng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，杭州 310008）

茶刺蛾核型多角體病毒多角體的增殖動(dòng)態(tài)與生產(chǎn)工藝

唐美君， 殷坤山， 郭華偉， 肖 強(qiáng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，杭州 310008）

為了解茶刺蛾核型多角體病毒（Iragoides fasciatanucleopolyhedrovirus IrfaNPV）的增殖特性、指導(dǎo)茶刺蛾病毒的生產(chǎn)，采用室內(nèi)活體增殖法，測(cè)定了IrfaNPV多角體在茶刺蛾幼蟲體內(nèi)的增殖動(dòng)態(tài)，并設(shè)計(jì)了工藝流程，進(jìn)行了大量繁殖生產(chǎn)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，IrfaNPV多角體在蟲體內(nèi)的增殖動(dòng)態(tài)符合Logistic曲線，飼毒后9～12 d為病毒快速增殖期。按設(shè)計(jì)的生產(chǎn)工藝進(jìn)行病毒大量繁殖生產(chǎn)，蟲尸中病毒多角體平均可達(dá)8.3×108PIB/頭，繭中病毒多角體含量平均為6.4×108PIB/頭。該工藝可用于今后茶刺蛾病毒的大量生產(chǎn)。

茶刺蛾； 核型多角體病毒； 增殖動(dòng)態(tài)； 生產(chǎn)工藝

茶刺蛾核型多角體病毒（Iragoides fasciatanucleopolyhedrovirus，簡(jiǎn)稱IrfaNPV）是茶園主要害蟲茶奕刺蛾［Iragoides fasciata（Moore）］（俗稱茶刺蛾）的優(yōu)勢(shì)病原天敵［1-3］。該病毒在茶刺蛾種群中自然感染率一般為20%～30%，高時(shí)可達(dá)70%以上，是控制茶刺蛾種群數(shù)量的重要生物因子［1］。該病毒的人工大量增殖是其廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。因此，闡明該病毒多角體的增殖動(dòng)態(tài)和大量繁殖的生產(chǎn)工藝，對(duì)于了解茶刺蛾病毒的增殖特性、指導(dǎo)茶刺蛾病毒的生產(chǎn)，進(jìn)而促進(jìn)其推廣應(yīng)用具有重要意義。

前人的研究明確了該病毒的形態(tài)、致病力、毒性和田間應(yīng)用效果［2-5］，其人工大量增殖的最優(yōu)條件也有報(bào)道［6］，但該病毒多角體的增殖動(dòng)態(tài)和生產(chǎn)工藝尚缺乏深入研究。為了更好地指導(dǎo)茶刺蛾病毒的生產(chǎn)，本文測(cè)定了IrfaNPV多角體在茶刺蛾幼蟲體內(nèi)的增殖動(dòng)態(tài)，設(shè)計(jì)了病毒生產(chǎn)工藝流程，進(jìn)行了大量增殖試驗(yàn)，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

茶刺蛾核型多角體病毒采自浙江紹興，通過室內(nèi)感染茶刺蛾幼蟲進(jìn)行病毒大量增殖獲得蟲尸，經(jīng)離心提純后，獲得病毒原液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

茶刺蛾幼蟲，通過室內(nèi)連續(xù)大量飼養(yǎng)獲得。飼養(yǎng)方法同文獻(xiàn)［6］。

1.2 IrfaNPV多角體增殖動(dòng)態(tài)

從田間采集新鮮茶樹葉片，在1×106PIB/mL病毒液中浸濕后晾干備用。挑取5齡幼蟲置于直徑15 cm的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿30頭，共600頭。用上述病毒液浸漬過的葉片飼喂幼蟲。在恒溫箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度（24±1）℃，濕度75%左右，光周期L∥D＝12 h∥12 h。飼毒后，每隔24 h取樣1次，直至幼蟲死亡或化蛹。每次隨機(jī)挑取幼蟲40頭，放在250 mL廣口瓶中，置于－18℃保存，并觀察記錄茶刺蛾的病癥和取食情況。取樣結(jié)束后，統(tǒng)一進(jìn)行病毒提純和顯微計(jì)數(shù)，方法同文獻(xiàn)［6］。

1.3 IrfaNPV大量繁殖

首先進(jìn)行茶刺蛾的大量飼養(yǎng)，在幼蟲飼養(yǎng)至6齡時(shí)進(jìn)行飼毒。從田間剪取新鮮茶枝，插在盛水的500 mL廣口瓶中。用小噴霧器將1×106PIB/mL的病毒液均勻噴在茶枝上，待藥液干后，將健康幼蟲轉(zhuǎn)移到茶枝上。室內(nèi)溫度控制在24～26℃，RH 70%～80%，自然光照。飼毒3 d后，將帶蟲茶枝移至養(yǎng)蟲框（46 cm×32 cm×17 cm）中，用無(wú)病毒葉片繼續(xù)飼養(yǎng)。幼蟲開始死亡時(shí)進(jìn)行病毒的收集，直至全部死亡或化蛹。每次試驗(yàn)供試蟲600～1 000頭。

收獲的蟲尸或繭加水浸泡后首先用組織搗碎機(jī)搗碎、過濾，濾液先經(jīng)自然沉淀取上清液后再離心，方法為：將濾液倒入500 mL量筒中進(jìn)行自然沉淀，分層后立即吸取上層液。在沉淀中再加入水，分層后再吸取上層液，重復(fù)3～4次，棄去沉淀。上層液用3 000 r/min離心30 min，去上清液，病毒多角體沉淀加水?dāng)噭蚝笤匐x心一次，最后用蒸餾水洗出多角體沉淀，獲得病毒原液。采用血球板顯微計(jì)測(cè)法測(cè)定多角體的數(shù)量，計(jì)算原液的多角體含量，再根據(jù)供試蟲數(shù)，計(jì)算出病毒產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行增殖動(dòng)態(tài)曲線的擬合，在Excel中作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 IrfaNPV多角體的增殖動(dòng)態(tài)

茶刺蛾核型多角體病毒增殖動(dòng)態(tài)測(cè)定結(jié)果表明，飼毒后1～8 d IrfaNPV增殖緩慢，病毒多角體含量在1×108PIB/頭以下，第9天起病毒多角體含量開始快速上升，至第12天達(dá)最高峰（3.77×108PIB/頭）。病毒多角體增殖動(dòng)態(tài)符合Logistic曲線（圖1）。

圖1 茶刺蛾核型多角體病毒的增殖動(dòng)態(tài)Fig.1 The dynamic of propagation of IrfaNPV

飼養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，飼毒后1～5 d內(nèi)，茶刺蛾幼蟲均正常取食，外表看沒有異常；6～8 d時(shí)，幼蟲開始不停爬動(dòng)，爬行十分迅速，顯得煩躁，并且取食較少；9 d后幼蟲爬行減少；10 d后基本不動(dòng)，并出現(xiàn)典型的病毒蟲尸。幼蟲感染病毒后癥狀表現(xiàn)與體內(nèi)病毒多角體增殖動(dòng)態(tài)基本吻合。

2.2 IrfaNPV大量繁殖生產(chǎn)工藝

以病毒多角體增殖動(dòng)態(tài)的試驗(yàn)結(jié)果和大量繁殖的最優(yōu)條件［6］為主要技術(shù)參數(shù)，參照昆蟲病毒生產(chǎn)的一般規(guī)律［7-8］，設(shè)計(jì)了IrfaNPV生產(chǎn)工藝流程（圖2）。整個(gè)生產(chǎn)工藝分為三個(gè)部分，首先是茶刺蛾幼蟲的大量飼養(yǎng)，其中95%的飼養(yǎng)幼蟲用于病毒繁殖，剩下的5%用于保種，繁殖下一代。第二步是IrfaNPV的大量增殖，主要技術(shù)參數(shù)為：在6齡中期飼毒，飼毒濃度1×106PIB/m L，持續(xù)飼毒時(shí)間3 d，飼養(yǎng)溫度24℃。最后是IrfaNPV的收集與提純，病死幼蟲和繭均需收集，在常規(guī)的離心提取之前采用自然沉淀法先去除一些較大的雜質(zhì)。

按照該工藝進(jìn)行病毒多角體大量繁殖生產(chǎn)試驗(yàn)，幼蟲蟲尸的病毒產(chǎn)量為5.9×108～10.4×108PIB/頭，平均8.3×108PIB/頭（表1）。此外，部分幼蟲會(huì)結(jié)繭化蛹，繭內(nèi)大多數(shù)為死亡的預(yù)蛹。繭中病毒含量高低不等，最低為2.1×108PIB/頭，最高則有10.2×108PIB/頭，平均為6.4×108PIB/頭。

圖2 IrfaNPV生產(chǎn)工藝流程Fig.2 The production process of IrfaNPV

表1 茶刺蛾核型多角體病毒的大量繁殖生產(chǎn)Table 1 The trial of the mass production of IrfaNPV

3 小結(jié)與討論

本文根據(jù)IrfaNPV的增殖特性，設(shè)計(jì)了其生產(chǎn)工藝。應(yīng)用該工藝流程進(jìn)行茶刺蛾病毒多角體的大量繁殖，死亡幼蟲病毒產(chǎn)量高（平均8.3×108PIB/頭），繭（蛹）中也含大量病毒（平均6.4×108PIB/頭）。該工藝可用于茶刺蛾病毒的大量生產(chǎn)。

本工藝流程為病毒多角體原藥的生產(chǎn)流程，生產(chǎn)獲得的病毒多角體原藥不需添加保護(hù)劑。后續(xù)加工可根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)的劑型添加相應(yīng)的助劑，如生產(chǎn)純病毒水劑可添加保護(hù)劑、增稠劑等，生產(chǎn)病毒Bt混劑則需將病毒多角體原藥添加至Bt產(chǎn)品中。由于病毒制劑多用于有機(jī)茶園，因此制劑中最好不添加人工合成的保護(hù)劑。病毒多角體原藥通常低溫冷藏（4℃左右）放置，一般可保存多年。如果加工成制劑（純病毒水劑或病毒Bt混劑），則通常為常溫放置，貨架壽命為1～2年。病毒制劑的田間應(yīng)用效果在88%以上［4-5］。

IrfaNPV的增殖動(dòng)態(tài)符合Logistic曲線，這與一般昆蟲病毒的增殖動(dòng)態(tài)［8］相一致。飼毒后9～12 d為該病毒快速增殖期，此時(shí)幼蟲已不大活動(dòng)，取食很少，幾乎停食。在病毒大量增殖過程中可否利用這一時(shí)期進(jìn)行蟲尸的一次性收集，以提高病毒生產(chǎn)的工效有待進(jìn)一步研究。

一般來說，昆蟲感染病毒后在末齡幼蟲的中后期死亡時(shí)病毒產(chǎn)量最高，太早死亡或在預(yù)蛹或蛹期死亡則產(chǎn)量低［9］。因此過去的病毒生產(chǎn)中均比較注重收集蟲尸，而忽略蛹的收集。本文研究結(jié)果顯示，茶刺蛾繭（蛹）中也含有大量病毒多角體，這可能與茶刺蛾幼蟲歷期較長(zhǎng)、在繭中以預(yù)蛹態(tài)死亡有關(guān)。因此在茶刺蛾病毒生產(chǎn)中除收集幼蟲蟲尸外也應(yīng)注重繭（蛹）內(nèi)病毒的收集提純。

通常茶刺蛾健康幼蟲的飼養(yǎng)可全年進(jìn)行，病毒多角體的生產(chǎn)則集中在幼蟲發(fā)生期內(nèi)（5－11月）完成。病毒多角體的產(chǎn)量取決于健康幼蟲的飼養(yǎng)總量和單頭蟲的病毒繁殖量。按本文提出的工藝生產(chǎn)，單頭幼蟲蟲尸或繭（蛹）的病毒多角體含量分別為8.3×108、6.4×108PIB。健康幼蟲的飼養(yǎng)總量可根據(jù)實(shí)際需要來確定。如預(yù)計(jì)來年約3 333 hm2茶園需采用病毒防治，則每批次需飼養(yǎng)1萬(wàn)頭幼蟲進(jìn)行病毒增殖，病毒多角體總量為6.5×1012～8.5×1012PIB，全年按4個(gè)批次計(jì)算，則可生產(chǎn)病毒多角體原藥2.6×1013～3.4×1013PIB。一般每667 m2茶園病毒多角體用量為5×108PIB，因此這些病毒多角體的量可供3 467～4 533 hm2茶園應(yīng)用。

［1］ 朱俊慶.茶樹害蟲［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，1999：72.

［2］ Yang L R，Xiao Q，Zhang BQ，et al.Characterization of a baculovirus newly isolated from the tea slug moth，Iragoidae fasciata［J］.The Journal of Microbiology，2009，47（2）：208 213.

［3］ 葉恭銀，胡萃，洪健，等.茶奕刺蛾核型多角體病毒形態(tài)和毒力的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1992，4（3）：133 136.

［4］ 唐美君，肖強(qiáng)，郭華偉，等.茶刺蛾核型多角體病毒制劑示范應(yīng)用試驗(yàn)［J］.中國(guó)茶葉，2007，29（3）：28 29.

［5］ 唐美君，殷坤山，郭華偉，等.茶刺蛾核型多角體病毒的毒性測(cè)定與田間應(yīng)用［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2010，37（1）：93 94.

［6］ 唐美君，殷坤山，郭華偉，等.茶刺蛾核型多角體病毒大量增殖的最優(yōu)條件［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2012，39（5）：473 474.

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［9］ 吳曉晶，胡萃.茶尺蠖核型多角體病毒的大量增殖研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1987，13（2）：150 157.

The propagation dynamics and production process of the nucleopolyhedroviruses of the tea slug mothIragoides fasciata

Tang Meijun， Yin Kunshan， Guo Huawei， Xiao Qiang
（Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou310008，China）

To guide the production ofIragoidesfasciatanucleopolyhedrovirus（IrfaNPV），the propagation dynamic of IrfaNPV was investigated in laboratory.Meanwhile，the production process was developed and the mass production of the virus was conducted according to the process.The results showed the propagation dynamic of IrfaNPV in the larval body accorded with logistic curve.The average yield of IrfaNPV reached 8.3×108PIB/larva and 6.4×108PIB/cocoon，respectively.The process is expected to be applied in mass production of IrfaNPV in the future.

Iragoides fasciata； nucleopolyhedroviruses； propagation dynamic； production process

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.036

2014 01 21

2014 04 16

國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2013FY113200）；浙江省茶產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2011R50024）

*通信作者 E-mail：tmjtea@163.com