謝昌平， 李博勛， 文衍堂， 鄭妃慶， 黃貴修*

（1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228；

2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海口 571101）

龍血樹根腐病病原菌的鑒定

謝昌平1， 李博勛2， 文衍堂1， 鄭妃慶1， 黃貴修2*

（1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228；

2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?571101）

龍血樹根腐病是一種系統(tǒng)性病害，該病引起植株地上葉片由黃色變?yōu)楹稚?，根部的皮層和木質(zhì)部分離，木質(zhì)部表面有白色的霉層，維管束呈紅棕色壞死，后期病根褐色腐爛。從發(fā)病的植株根部分離、純化病原菌，經(jīng)致病性測定、形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀觀察和rDNA-ITS序列的分析鑒定表明，引起龍血樹根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumSchl.）。

龍血樹； 尖孢鐮刀菌； 形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)性狀； rDNA-ITS； 鑒定

龍血樹（Dracaena angustifoliaRoxb.）屬百合科（Liliaceae）、龍血樹屬（Dracaena）［1］。在我國主要分布在云南、廣西、海南及臺(tái)灣地區(qū)［2］。其植株不僅具有獨(dú)特的園林景觀價(jià)值，而且還具有很強(qiáng)的吸收有毒有害物質(zhì)的能力，可清新室內(nèi)空氣。因此，龍血樹被廣泛置于廳堂、客房和酒店等公共建筑內(nèi)，以增加室內(nèi)綠色和雅趣［3］。龍血樹的木質(zhì)部在受外力損傷或遭真菌侵入后分泌的紅色樹脂，被稱為“龍血”，部分品種是提煉名貴中藥“血竭”的原料植物［4］。國內(nèi)已經(jīng)報(bào)道的龍血樹病害有炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）、褐斑?。↙eptosphaeria draconis）、可可球二孢葉斑?。˙otryodiplodia theobromae）、擬莖點(diǎn)霉葉斑?。≒homopsis dracaen-icola）、彎孢霉灰斑?。–urvularia lunata）、彎孢霉褐斑病（Curvularia senegalensis）、擬盤多毛孢葉斑病（Pestalotiopsis clavispora）、擬莖點(diǎn)霉灰斑?。≒homopsis dracaenae）、球殼孢葉枯?。⊿phaeropsis dracaenae）、頂多毛孢葉斑?。˙artalinia dracaenae）［5］以及龍血樹莖腐?。═hielaviopsis paradoxa）［6］、龍血樹白絹?。⊿clerotinmrolfsii）［7］和龍血樹灰霉?。˙otrytis cinerea）［8］。目前，筆者在海南省?？诟浇亩鄠€(gè)龍血樹花圃中發(fā)現(xiàn)一種危害根部的病害，嚴(yán)重地塊發(fā)病率可達(dá)到30%～50%。大量龍血樹發(fā)病，根部嚴(yán)重腐爛，失去觀賞價(jià)值，嚴(yán)重影響龍血樹生產(chǎn)。本試驗(yàn)對(duì)該病的病原菌做了鑒定，以期為病害的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

發(fā)病材料來自?？谑协偵絽^(qū)演豐鎮(zhèn)龍血樹花圃基地的典型病株。

1.2 癥狀描述

按常規(guī)方法對(duì)田間病株癥狀和橫切病根后內(nèi)部癥狀進(jìn)行描述并拍照。

1.3 菌株的分離與純化

采用常規(guī)組織分離法分離［9］，取發(fā)病典型的病根，剝下皮層，切取大小為4～5 mm的組織塊，用70%的乙醇浸數(shù)秒后，用0.1%升汞表面消毒1～2 min，然后用無菌水沖洗3次，將其轉(zhuǎn)移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，置于28℃全光照恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察病原菌的生長情況。待菌種產(chǎn)孢后，采用瓊脂平板稀釋純化法進(jìn)行純化［10］。將純化的菌株轉(zhuǎn)入試管斜面保存。

1.4 菌株的致病性測定

用純化的菌株接種種植在經(jīng)121℃滅菌1 h基質(zhì)中的1年生龍血樹健康組培種苗的根部。接種時(shí)剖開根部表土露出根部，用滅菌針刺傷根部。挑取菌絲塊放入無菌水中將孢子洗脫，用血球計(jì)數(shù)板測定孢子懸浮液濃度，用無菌水將孢子懸浮液濃度調(diào)至104個(gè)孢子/mL。取孢子懸浮液20 mL澆灌在根部的傷口處，填回基質(zhì)后正常管理。共處理10株。同時(shí)，選5株用滅菌水澆灌根部有傷口的植株作為對(duì)照，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.5 病原菌形態(tài)觀察

將純化后的病原菌分別接種到PDA和馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）和米飯培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察菌落的培養(yǎng)性狀，包括菌落的形狀、顏色和有無氣生菌絲等；病原形態(tài)的觀察包括分生孢子的類型、形狀、大小、色澤、分隔數(shù)和大小等。

1.6 病原菌rDNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增和分析

1.6.1 基因組DNA的提取

采用CTAB提取總DNA［11］。

1.6.2 病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增

通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：dd H2O 18μL、10×buffer 2.5μL、dNTP（2.5 mmol/L）1μL、ITS1（10pmol/L）1μL、ITS4（10 pmol/L）1μL、TaqDNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5μL、模板DNA（0.5 ng/μL）1μL，總體積25μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；60℃退火1 min；72℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；72℃完全延伸10 min。反應(yīng)完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6.3 病原菌rDNA-ITS序列同源性比較

根據(jù)致病性測定結(jié)果，選擇致病菌株D2進(jìn)行序列測定，并運(yùn)用核酸數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具軟件，在DNA序列數(shù)據(jù)庫中搜索同源DNA序列并進(jìn)行比較分析，根據(jù)BLAST搜索和比較的結(jié)果，進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀描述

地上部分的癥狀：葉片由綠色變?yōu)闇\黃色，葉片下垂，下層葉片逐漸由淺黃色變黃色，繼而變?yōu)辄S褐色至褐色，最后干枯。葉片缺乏光澤，呈缺水狀（圖1a～c）。

地下根部的癥狀：多從根尖或根部分叉處開始發(fā)病，發(fā)病初期病根變?yōu)樗疂n狀棕黃色，病根很快壞死，并由根尖逐漸向主根擴(kuò)展，隨著病部的進(jìn)一步擴(kuò)展，病根腐爛，其皮層與木質(zhì)部極易分離，將分離的皮層剝?nèi)ィ梢妰?nèi)部的木質(zhì)部也變?yōu)樽攸S色，在發(fā)病中后期病根木質(zhì)部上可見白色的霉層，顯微鏡檢查可見大量的大型分生孢子、小型孢子、分生孢子梗和菌絲體。橫切病根可見病根的維管束變?yōu)榧t棕色壞死（圖1d～f）。最后病根全部腐爛，散發(fā)臭味。

2.2 菌株的致病性測定

將分離純化后的菌株D1和D2分別接種到健康的根上，經(jīng)過30～45 d的觀察，接種D2菌株的植株葉片由綠色逐漸變?yōu)闇\黃色，葉片下垂，繼而變?yōu)辄S褐色至褐色，根變?yōu)樗疂n狀棕黃色，逐漸壞死，其發(fā)病率100%（發(fā)病株數(shù)/接種株數(shù)：10/10）（圖1g～i）。而接種D1菌株的植株和對(duì)照株均健康（發(fā)病株數(shù)/接種株數(shù)分別為0/10和0/5）（圖1j）。從發(fā)病的根部分離到D2菌株，符合柯赫氏法則。

圖1 龍血樹根腐病的田間癥狀和人工接種的癥狀Fig.1 Symptoms ofDracaena angustifoliaroot rot disease in the field and after artificial inoculation

2.3 病原菌形態(tài)特征

病原菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上25℃培養(yǎng)4 d后菌落直徑48～55 mm；菌絲體為羊毛狀，放射狀條紋不明顯；少有氣生菌絲，氣生菌絲棉絮狀，有少量團(tuán)絮；菌落背面呈桃紅色至紫紅色，僅產(chǎn)生小型分生孢子，不產(chǎn)大型分生孢子。在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）上25℃培養(yǎng)4 d后菌落直徑47～53 mm；菌絲體為羊毛狀，放射狀條紋明顯；氣生菌絲棉絮狀，繁茂，團(tuán)絮多；菌落背面呈玫瑰紅至深紫紅色。容易產(chǎn)小型分生孢子，產(chǎn)少量大型分生孢子。在米飯培養(yǎng)基上氣生菌絲繁茂，棉絮狀，易團(tuán)絮，菌落背面玫瑰紅，易產(chǎn)生大型分生孢子。大型分生孢子無色，鐮刀形，頂端細(xì)胞窄細(xì)呈喙?fàn)顝澢惆惶黠@，3～5個(gè)分隔，一般為3個(gè)分隔，大小為3.5～5.5（4.6）μm×25.5～40.6（34.7）μm；小型分生孢子卵形、橢圓形或腎形，一般無分隔，極少數(shù)有1個(gè)分隔，大小為4.7～11.4（7.1）μm×2.2～3.8（2.7）μm（圖2a）。厚垣孢子大量，多單生、少數(shù)頂生，球形，直徑為7.5～13.4（8.6）μm（圖2b）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和相關(guān)資料［12-15］初步確定該病原菌為鐮刀菌屬（Fusarium）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumSchl.）。

圖2 龍血樹根腐病菌的形態(tài)Fig.2 Morphology of the pathogen causing root rot onD.angustifolia

2.4 病原菌rDNA-ITS的分子鑒定

將克隆和測序得到的致病菌株D2的rDNA-ITS序列（GenBank登錄號(hào)：EF495230.1）在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示：待測菌株rDNA-ITS與Fusarium oxysporum（GenBank登錄號(hào)：EF495230.1、AY18-8919.1、JF776163.1、DQ452450.1和DQ452454.1）的同源性達(dá)到100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定引起龍血樹根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌（FusariumoxysporumSchl.）。

3 討論

通過對(duì)種植地的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)海口市瓊山區(qū)演豐鎮(zhèn)龍血樹花圃基地的土壤類型以沙壤土為主，前作較為復(fù)雜，有些地塊前作是香蕉和荔枝，有的地塊是灌木雜草。種植香蕉的地塊是否曾經(jīng)發(fā)生過香蕉枯萎病以及是否與龍血樹根腐病的發(fā)生有一定關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

該病一年四季均可發(fā)病，但在夏秋季高溫季節(jié)癥狀較明顯，發(fā)病較重。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)該病原菌主要通過根部的傷口和根尖侵入而引起發(fā)病。在栽培管理上，應(yīng)盡可能減少根部的機(jī)械傷口，以減少病原菌的侵入。

本試驗(yàn)從海口瓊山區(qū)演豐鎮(zhèn)3個(gè)花圃取樣20余株病株，此外從龍?jiān)奇?zhèn)、三門坡鎮(zhèn)也取樣數(shù)次，并分離病原菌，從根部分離出2種鐮刀菌菌株，其中1種是致病菌。通過對(duì)病原菌的形態(tài)學(xué)分析和rDNA-ITS序列測定，將病原鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。由尖孢鐮刀菌引起龍血樹根腐病在國內(nèi)尚屬首次報(bào)道。

尖孢鐮刀菌寄主范圍廣泛，可引起西瓜、黃瓜、香蕉、辣椒和番茄等100多種植物發(fā)生毀滅性的枯萎病，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［16］。該菌為典型的土傳病害真菌，屬土壤習(xí)居菌，是一類在土壤和有機(jī)質(zhì)中數(shù)量多而活躍的病原菌［17］。因此，在該病害防治上首先應(yīng)選用無病菌土壤，并采取輪作等措施。

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Identification of root rot pathogen onDracaena angustifolia

Xie Changping1， Li Boxun2， Wen Yantang1， Zheng Feiqing1， Huang Guixiu2
（1.College of Environmental and Plant Protection，University of Hainan，Haikou570228，China；2.Institute
of Environment and Plant Protection，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou571101，China）

Root rot ofDracaena angustifoliaRoxb.is a systemic disease.The diseased leaves ofD.angustifoliachanged from yellow to brown，The xylems of the roots separated from the cortexes.The surface of the xylems covered white mold.The vascular bundles were necrosis with reddish brown.The diseased roots were brownish rot at later stage.The pathogen was isolated from the roots，purified from the infectedD.angustifoliaand its pathogenicity was tested.Morphological characters，culture characters and rDNA-ITSsequence analysis indicated that the pathogen wasFusarium oxysporumSchl.

Dracaena angustifolia；Fusarium oxysporum； morphology and culture characters； r DNA-ITS；identification

S 436.8

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.025

2014 01 19

2014 04 10

海南省科技基金項(xiàng)目（Rnd0524）

*通信作者 Tel：0898 66969219；E-mail：hgxiu@vip.163.com