王 靜， 孔凡玉， 陳曉紅， 田 華，3

（1.中國煙草總公司青州煙草研究所煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測及綜合治理重點實驗室，青島 266101；2.山東臨沂煙草有限公司沂南分公司，臨沂 276300；3.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

短小芽胞桿菌AR03對煙草炭疽病的抑制作用

王 靜1， 孔凡玉1， 陳曉紅2， 田 華1，3

（1.中國煙草總公司青州煙草研究所煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測及綜合治理重點實驗室，青島 266101；2.山東臨沂煙草有限公司沂南分公司，臨沂 276300；3.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

為測定短小芽胞桿菌AR03菌株對煙草炭疽病菌的室內(nèi)拮抗活性和盆栽防治效果，采用平板拮抗法初步篩選菌株拮抗活性，采用抑制菌絲生長法及抑制孢子萌發(fā)法篩選該菌株菌懸液的抑菌濃度，采用噴霧法進行防治效果測定。AR03菌株對煙草炭疽病菌的拮抗活性很強，能顯著抑制菌絲生長、孢子萌發(fā)和病害發(fā)生，濃度為1× 107cfu/mL的AR03發(fā)酵液能有效抑制菌絲的生長和孢子萌發(fā)，AR03菌懸液（1×108cfu/mL）對炭疽病的盆栽防治效果為83.03%，與對照藥劑25%三唑酮可濕性粉劑的防治效果相當。AR03菌株是一株優(yōu)良的廣譜高效生防菌株。

短小芽胞桿菌； 煙草； 植物促生細菌； 生物防治

煙草炭疽病是煙草的主要葉部病害之一，其病原為毀滅炭疽病菌（Colletotrichum destructivum）［1-2］，此病在煙草各生育期皆可發(fā)生，但以苗期普遍發(fā)生，尤其是煙區(qū)集約化育苗過程中發(fā)生更為普遍，病害嚴重時往往整片煙苗毀壞，煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量嚴重下降［3］。目前對該病害的防治主要是利用化學藥劑，但化學藥劑的使用對煙葉及環(huán)境均存在一定安全隱患，隨著化學農(nóng)藥的使用量和應用范圍被限制，采取其他有效防治措施對該病害進行綜合防治，已成為一種必然趨勢，其中生物防治逐漸成為防治植物病害的研究熱點。利用拮抗微生物控制煙草炭疽病對煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。國內(nèi)外關(guān)于煙草炭疽病生物防治的研究還比較少，萬秀清等從400份煙草根際細菌中篩選獲得1株含DAPG（2，4-二乙?；冱S酚）和PCA（吩嗪-1-羧酸），并對煙草炭疽病菌具有明顯拮抗作用的熒光假單胞桿菌［4］。植物促生細菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）對植物的有益作用主要表現(xiàn)在防病和刺激生長兩個方面，對病害的防治機制包括拮抗、競爭、寄生等多種方式，刺激作物生長主要通過細菌產(chǎn)生植物激素，這些激素對微生物生長是必需的，同時也能對其生活環(huán)境中的其他生物具有促進生長的作用［5］。短小芽胞桿菌AR03（ZL201110146683.8）是本實驗室分離的一株具有廣譜抑菌作用的PGPR菌株［6］，該菌株對煙草具有促生效應，且對青枯病和黑脛病具有很好的防治效果［7-8］，本研究進一步測定了該菌株對煙草炭疽病菌的拮抗活性、抑菌濃度及其發(fā)酵液對炭疽病的盆栽防治效果，為煙草炭疽病生物防治提供高效且廣譜抗菌的新菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試菌株與植物：AR03菌株，由本實驗室分離保存（20%甘油、－20℃）。炭疽病菌TJ1（Colletotrichum destructivumO’Gara），分離自山東諸城；供試煙草品種為‘NC89’。

（2）培養(yǎng)基：常規(guī)的NA與NB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)AR03菌株；PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)炭疽病菌TJ1，培養(yǎng)基配方參照文獻［8］制備。

（3）對照藥劑：25%三唑酮可濕性粉劑（昆明云大科技農(nóng)化有限公司產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 AR03及其發(fā)酵液對TJ1的拮抗活性

接種AR03于NA平板上28℃培養(yǎng)48 h，然后采用平板對峙法，即在PDA平板的中心接種TJ1菌株的菌餅（直徑為5 mm），用接種環(huán)蘸取AR03于菌餅兩邊等距離畫線，置于28℃培養(yǎng)5 d，觀察TJ1菌株的生長情況。將活化的AR03接種于NB培養(yǎng)液中，28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h得到其發(fā)酵原液（濃度為4×1011cfu/mL），取200μL發(fā)酵液與20 mL PDA于培養(yǎng)皿內(nèi)混合均勻，將TJ1菌餅置于平板中央，于28℃培養(yǎng)5 d，觀察TJ1菌株的生長情況。

1.2.2 AR03發(fā)酵液對TJ1菌絲生長的影響

將發(fā)酵原液進行梯度稀釋，獲得1×107、1× 106、1×105cfu/mL 3個濃度。采用菌落直徑法，分別取上述3個濃度的發(fā)酵液200μL與20 mL熔化的PDA培養(yǎng)基混勻，倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成含菌平板，將TJ1菌株的菌餅（5 mm）置于平板中央，以空白的LB液體培養(yǎng)基為對照，28℃培養(yǎng)7 d后，測量菌落直徑，并挑取處理后病原菌菌絲進行鏡檢（尼康E100型顯微鏡）。

1.2.3 AR03發(fā)酵液對TJ1孢子萌發(fā)的影響

首先制備TJ1孢子懸浮液，移液槍吸取適量無菌水反復沖洗吹打PDA平板上的TJ1菌落，洗下的孢子和菌絲經(jīng)3層無菌紗布過濾，即得到一定濃度的孢子懸浮液，血球計數(shù)板計數(shù)后，用無菌水進行梯度稀釋，將懸浮液濃度調(diào)整為1×105個/mL。將上述3個濃度的發(fā)酵液與孢子懸浮液各70μL混合滴于帶有凹槽的載玻片上，26℃、100%濕度條件下放置10 h后鏡檢觀察孢子萌發(fā)情況。

1.2.4 AR03對煙草炭疽病的盆栽防治效果

AR03發(fā)酵液參照1.2.1所述方法制備，10 000 r/ min離心10 min，去上清，收集菌體，蒸餾水稀釋菌體至濃度為1×108cfu/mL，對4片真葉的煙苗進行整株噴霧，每處理8株煙苗，3次重復。間隔7 d，第2次噴施AR03菌懸液6 h后，均勻噴施濃度為1×105個/ mL的TJ1孢子懸浮液，藥劑對照采用25%三唑酮可濕性粉劑500倍噴霧，另設清水處理為空白對照。將上述處理置于密閉環(huán)境中保濕48 h后，按照常規(guī)溫室管理，第9天調(diào)查發(fā)病率及發(fā)病嚴重度，嚴重度分級按照煙草病害分級及調(diào)查方法（GB/T 23222 2008）；發(fā)病率、病情指數(shù)及防效用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AR03菌株及其發(fā)酵液的拮抗活性

平板對峙培養(yǎng)的結(jié)果（圖1）顯示，AR03菌株對炭疽病菌TJ1具有較好的抑菌效果，表現(xiàn)為對病原菌菌落擴展具有顯著的抑制作用，TJ1菌落的邊緣及與抑菌帶接觸的菌絲變枯萎、稀疏，并停止生長。混菌平板的抑制效果亦很明顯，TJ1菌絲幾乎未見生長。

圖1 AR03菌株對TJ1的拮抗活性Fig.1 Inhibitory activity of strain AR03 against TJ1

2.2 AR03發(fā)酵液對TJ1菌絲生長的影響

試驗結(jié)果如表1所示，供試3個濃度的AR03發(fā)酵液均能不同程度地抑制TJ1菌落的生長，處理后的菌落生長緩慢、菌絲顏色變深且稀疏，隨著濃度的增大，抑制率增強，其中以1×107與1×106cfu/ mL濃度的抑制效果較好，分別為92.93%和87.19%，而1×105cfu/mL濃度的抑制效果僅為50.54%；鏡檢結(jié)果顯示，與對照（圖2a）相比，經(jīng)AR03處理過的菌絲變粗、呈彎曲狀，隔膜之間的菌絲縮短、膨大，其內(nèi)的原生質(zhì)濃縮聚集，嚴重變形的菌絲還盤結(jié)成團（圖2b），從而不能正常生長；而對照的菌絲生長正常。

圖2 AR03發(fā)酵液對TJ1菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Inhibitory effects of AR03 fermentation broth on the hyphae morphology ofC.destructivum

2.3 AR03發(fā)酵液對TJ1孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果如表2、圖3顯示，拮抗細菌AR03的發(fā)酵液在1×107、1×106和1×105cfu/m L濃度均能抑制炭疽病菌TJ1孢子的萌發(fā)，隨著濃度的減小，抑制率減弱，處理10 h后，以1×107cfu/mL濃度抑制孢子萌發(fā)的作用最強，孢子萌發(fā)率僅為12.17%，抑制率達到86.36%。經(jīng)鏡檢觀察，TJ1菌株的孢子經(jīng)AR03發(fā)酵液處理后，不能萌發(fā)的孢子嚴重畸形，膨大變粗，棒形孢子兩端變突出，呈鈍圓形（圖3b，c），孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管生長點膨大呈鈍圓狀、致畸，生長緩慢，失去進一步發(fā)育為菌絲體的能力，而對照的孢子萌發(fā)正常（圖3a）。

表1 不同濃度AR03發(fā)酵液對TJ1菌落生長的抑制作用Table 1 The inhibitory effects of AR03 fermentation broth at different concentrations on the colony growth ofC.destructivum

2.4 AR03菌懸液對煙草炭疽病的溫室防治效果

AR03菌懸液噴霧處理對煙草炭疽病的抑制試驗結(jié)果（表3）表明，接種后第9天，AR03菌懸液的防病效果為83.03%，25%三唑酮可濕性粉劑處理的防病效果為80.17%，即AR03菌株處理的防效略高于化學藥劑處理，但2個處理在0.05水平上差異不顯著。并且AR03菌株對煙草具有明顯的促生作用，表現(xiàn)為地上部的煙株葉片增大，葉色濃綠，生長勢強。

圖3 AR03發(fā)酵液對TJ1孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of AR03 fermentation broth on the spore germination ofC.destructivum

表2 不同濃度拮抗細菌AR03發(fā)酵液對TJ1孢子萌發(fā)的抑制作用1）Table 2 The inhibitory effects of AR03 fermentation broth at different concentrations on the spore germination ofC.destructivum

表3 AR03菌懸液對煙草炭疽病的抑制效果Table 3 The control effects of bacterial suspension of AR03 on tobacco anthracnose

3 討論

煙草是葉用經(jīng)濟作物，而煙草炭疽病是危害煙草苗期的重要葉斑類病害，在實際生產(chǎn)中一般采用化學藥劑防治，化學藥劑的大量使用會造成抗藥性和環(huán)境污染等一系列問題，經(jīng)濟、安全、有效的生物防治措施越來越受到人們的重視。國內(nèi)關(guān)于短小芽胞桿菌用于植物病害生物防治已有報道［10-11］，但用于煙草炭疽病的生物防治尚未見報道。

本研究的結(jié)果表明，AR03菌株及其發(fā)酵液對煙草炭疽病菌菌絲、孢子萌發(fā)均具有較好的抑制作用，平板試驗顯示，濃度為1×107cfu/mL的AR03發(fā)酵液能較好地抑制煙草炭疽病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)。對菌絲的作用表現(xiàn)為菌絲膨大、隔間縮短，菌絲內(nèi)原生質(zhì)聚集，菌絲彎曲聚集成團；對孢子萌發(fā)的抑制作用表現(xiàn)為孢子萌發(fā)率降低，且孢子畸形，膨大、變形，萌發(fā)的孢子產(chǎn)生的芽管生長點膨大呈鈍圓狀、畸形，生長緩慢，失去進一步發(fā)育為菌絲體的能力。AR03菌懸液對炭疽病的盆栽防效較好，與化學藥劑25%三唑酮可濕性粉劑防效相當，顯示出其作為生物農(nóng)藥的潛力。

迄今為止，已有許多關(guān)于PGPR用于植物病害的防治和促進植株生長的報道，PGPR菌株對植物的有益作用主要表現(xiàn)在防病和刺激生長兩個方面，PGPR能夠通過提高出苗率，促進幼苗早期快速生長，從而有效防治猝倒、立枯及根腐等作物早期的病害，PGPR的利用已成為植物病害生物防治的重要內(nèi)容［12-14］。短小芽胞桿菌作為土壤植物根際重要的PGPR菌群之一，其用于植物病害的生防潛能已經(jīng)被許多試驗研究證實，目前國外主要將短小芽胞桿菌應用于防治蔬菜的根際病害，Akhtar等［15］報道短小芽胞桿菌用于防治鷹嘴豆根腐病有較好的防治效果；黃靜文等［16］從烤煙葉面上分離篩選得到1株短小芽胞桿菌Van35（Bacillus pumilus35），經(jīng)該菌株處理煙絲后，能明顯提調(diào)煙香、細膩醇和煙氣、降低刺激性、掩蓋雜氣和改善卷煙吸味的效果。短小芽胞桿菌AR03是本實驗室分離的1株P(guān)GPR菌株，該菌株已獲得發(fā)明專利，其不但對煙草主要根莖病害如黑脛病和青枯病具有較好的防效，而且對重要葉斑病害包括炭疽病和赤星?。砦膱蟮溃┑囊种谱饔靡草^強。可能是該菌株分泌廣譜的抗生物質(zhì)，從而對煙草多種病害起到抑制作用，同時促進植物生長。該菌耐貯存，抗逆性好，重新引入環(huán)境中不會導致環(huán)境污染，具有很好的開發(fā)前景。但該菌株的抗病、促生機制尚不清楚；且溫室環(huán)境與田間存在較大差異，因此本研究的短小芽胞桿菌AR03菌株在田間的防治效果及使用方法還有待于進一步研究。

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The inhibitory effect ofBacillus pumilusAR03 against tobacco anthracnose

Wang Jing1， Kong Fanyu1， Chen Xiaohong2， Tian Hua1，3
（1.Key Laboratory of Tobacco Pest Monitoring，Controlling&Integrated Management，Qingzhou Tobacco Research
Institute of China National Tobacco Corp，Qingdao266101，China；2.Yinan Tobacco Company of
Shandong Linyi Tobacco Co.，Ltd.，Linyi276300，China；3.Graduate School of Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081，China）

The inhibitory effects ofBacillus pumilusAR03 strain on tobacco anthracnose（Colletotrichum destructivum）were evaluated by culture assay and pot experiments in this study.The results showed that the AR03 strain had a good inhibitory effect onC.destructivumin both culture assay and pot experiments.The fermentation broth of AR03（1×107cfu/mL）could significantly inhibit the mycelium growth and spore germination.Pot test effect of AR03 bacterial suspension（1×108cfu/mL）was 83.03%，well matched with the protective effect of 25%triadimefon WP.The strain AR03 is a broad-spectrum，and efficient biocontrol strain.

Bacillus pumilus； tobacco； PGPR； biocontrol

S 482.292

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.020

2013 11 14

2014 08 18

中國煙草總公司重點項目（110200902065）；四川省煙草專賣局項目（201003013）

聯(lián)系方式 wangjing06@caas.cn