盧美光， 吳 冰， 高 蕊， 張志想， 肖 紅， 陳冉冉， 李世訪

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

我國(guó)部分地區(qū)櫻桃病毒病害初步調(diào)查和病原檢測(cè)

盧美光， 吳 冰， 高 蕊， 張志想， 肖 紅， 陳冉冉， 李世訪*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

對(duì)山東泰安、遼寧大連和北京的櫻桃病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)8個(gè)果園/栽培區(qū)均有病毒病發(fā)生，主要癥狀為葉片皺縮、畸形、卷葉、花葉、植株矮縮等。采集20份樣品，利用12種病毒的引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，在樣品中擴(kuò)增出與櫻桃病毒A（Cherry virus A，CVA）、李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV），李矮縮病毒（Prune dwarf virus，PDV）、李樹皮壞死與莖痘伴隨病毒（Plumbark necrosis stem pitting-associated virus，PBNSPaV）、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherry green ring mottle virus，CGRMV）、櫻桃小果病毒-1（Little cherry virus-1，LCh V-1）預(yù)期大小一致的目的片段；序列分析表明，與GenBank中注冊(cè)所測(cè)的病毒核苷酸序列均具有較高的一致性。其中，大連、泰安和北京樣品均檢測(cè)到CVA；大連和北京樣品中檢測(cè)到PNRSV和PDV；北京樣品中檢測(cè)到PBNSPaV；大連苗木樣品枝條中檢測(cè)到CGRMV和LCh V-1。這是在我國(guó)櫻桃上首次檢測(cè)到LCh V-1。

櫻桃； 病毒病； 病原檢測(cè)； LCh V-1

栽培櫻桃具有較高經(jīng)濟(jì)效益，近幾年在我國(guó)各地發(fā)展較快。甜櫻桃（Prunus aviumL.）又名大櫻桃，是我國(guó)目前主要栽培種類，包括‘紅燈’，‘紅艷’，‘美早’，‘薩米脫’，‘拉賓斯’等品種。大櫻桃在山東、遼寧、河北、北京、山西、江蘇、安徽、河南、甘肅、新疆等地均有栽培種植，主要集中在山東煙臺(tái)、遼寧大連、河北秦皇島等地。近年來，病毒病呈日益加重的趨勢(shì)，成為影響櫻桃產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。據(jù)國(guó)外報(bào)道，侵染大櫻桃的病毒約有34種，比較常見主要有20種［1］。我國(guó)已報(bào)道的侵染櫻桃的病毒有11種，包括蘋果花葉病毒（Apple mosaic virus，Ap MV）［2］，李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）［2-3］，李矮縮病毒（Prune dwarf virus，PDV）［3-4］，蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV）［4］，櫻桃銼葉病毒（Cherry rasp leaf virus，CRLV）［5］，櫻桃病毒A（Cherry virusA，CVA）［6］，黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）［7］，櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherry green ring mottle virus，CGRMV）［8］，李樹皮壞死與莖痘伴隨病毒（Plum bark necrosis stem pitting-associated virus，PBNSPaV）［9］，櫻桃小果病毒-2（Little cherry virus-2，LChV-2）［10］，櫻桃壞死銹狀斑駁病毒（Cherry necrotic rusty mottle virus，CNRMV）［11］。在已報(bào)道的櫻桃病毒檢測(cè)研究中，或?qū)δ承┑貐^(qū)，某一個(gè)或幾個(gè)病毒進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，陸續(xù)報(bào)道檢測(cè)到了這11種病毒，其中在我國(guó)檢出率較高、發(fā)生較普遍的櫻桃病毒主要有PNRSV、CVA和PDV。

2014年4－7月，我們依據(jù)已有研究進(jìn)展并結(jié)合在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)櫻桃病毒病鑒定的要求，對(duì)我國(guó)部分櫻桃主產(chǎn)區(qū)（環(huán)渤海地區(qū)的山東泰安、遼寧大連和北京）病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查和采樣檢測(cè)。對(duì)這11種櫻桃病毒及可能發(fā)生的LCh V-1進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，以期為病毒病的發(fā)生情況和病原鑒定提供更加全面的依據(jù)，為及早進(jìn)行綜合防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

有病毒病害癥狀和無癥狀櫻桃葉片和枝條樣品共20份，于2014年4－5月分別采自山東泰安、遼寧大連和北京的櫻桃園內(nèi)不同櫻桃植株，樣品清單如表1。對(duì)采集區(qū)櫻桃園的病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，記錄發(fā)病癥狀并拍照。

表1 從山東、遼寧和北京采集的櫻桃樣品Table 1 Cherry samples collected from Shandong，Liaoning and Beijing

1.1.2 主要試劑和儀器

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Polysaccharides&Polyphenolics-rich RNAprep Pure）購(gòu)自天根生物技術(shù)（北京）公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen試劑公司；其他儀器包括Bio-Rad PCR儀、KCBIO-2800凝膠成像系統(tǒng)和中國(guó)DYY-6B型穩(wěn)壓電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 田間調(diào)查和采樣

于2014年4－5月對(duì)山東泰安、遼寧大連和北京的8個(gè)櫻桃園/栽培區(qū)的櫻桃植株進(jìn)行隨機(jī)調(diào)查，觀察田間發(fā)病癥狀和發(fā)病情況，并進(jìn)行拍照；對(duì)疑似病毒病和無發(fā)病癥狀的植株，采集其枝梢幼嫩部位葉片或枝條并標(biāo)號(hào)（表1），用于室內(nèi)RT-PCR的病原檢測(cè)，綜合分析櫻桃病毒病發(fā)生情況。

1.2.2 植物總RNA提取

采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取植物總RNA，具體操作步驟按操作指南。得到RNA溶液于－80℃冰箱中保存，待用。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)

用于檢測(cè)的12個(gè)病毒的相關(guān)引物設(shè)計(jì)參考國(guó)內(nèi)外已報(bào)道文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)（表2）。

表2 RT-PCR反應(yīng)所用特異性引物Table 2 Virus-specific detection primers used in RT-PCR assay

反轉(zhuǎn)錄體系為10μL：d NTPs（2.5 mmol/L）2μL，5×M-MLV buffer 2μL，M-MLV（200 U/μL）0.5μL，RNase inhibitor（40 U/μL）0.5μL，R-特異引物或隨機(jī)六聚引物和Oligo（d T）18引物各0.5μL，植物總RNA 1μL，用無菌雙蒸水補(bǔ)足到10μL，混勻，室溫放置10 min，42℃溫育1 h，然后進(jìn)行PCR。為保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性，其中，LCh V-1、LCh V-2、CRLV、Ap MV、CMV、CNRMV用R-特異引物取代隨機(jī)六聚引物和Oligo（d T）18引物作進(jìn)一步檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為15μL：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.2μL，2×TaqPCR mix 7.5μL，正、反向引物各0.5μL（CGRMV，ACLSV，PNRSV各為20μmol/L，其他正、反向引物各為15μmol/L），用無菌雙蒸水補(bǔ)足到15μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)；94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50～55℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min。4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，在DYY-6B型穩(wěn)壓電泳儀，100V下電泳30 min左右，電泳膠于KCBIO-2800凝膠成像分析儀中照相，分析電泳結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物克隆及序列分析

PCR產(chǎn)物的純化、連接轉(zhuǎn)化和克隆篩選：按試劑盒操作指南，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的純化。分別將CVA、CGRMV、PDV、PNRSV、LCh V-1、PBNSPaV、LCh V-2、CNRSV的8個(gè)PCR純化產(chǎn)物連接至克隆載體p MD18-T，轉(zhuǎn)化大腸感菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選白色單菌落置于1 mL LB（含氨芐青霉素Amp）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過菌液PCR檢測(cè)來鑒定重組質(zhì)粒。

目的片段的序列測(cè)定和分析：經(jīng)菌液PCR，每個(gè)病毒各篩選3個(gè)陽性菌液送至金唯智生物科技（北京）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。用DNAMAN軟件對(duì)所得基因序列進(jìn)行分析。通過BLAST（http：∥www. ncbi.nlm.nih.gov/）與相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)分析，從而鑒定檢測(cè)的目的片段。

2 結(jié)果與分析

2.1 我國(guó)部分地區(qū)櫻桃病毒病害的初步調(diào)查

2014年4－5月對(duì)我國(guó)環(huán)渤海地區(qū)的山東泰安、遼寧大連和北京的8個(gè)櫻桃園/栽培區(qū)櫻桃病毒病發(fā)生情況進(jìn)行隨機(jī)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，各個(gè)果園/栽培區(qū)均有病毒病發(fā)生，主要癥狀表現(xiàn)為葉片皺縮、卷葉、褪綠、花葉、葉片細(xì)長(zhǎng)、畸形、碎葉、植株矮縮、嚴(yán)重的不結(jié)果等（圖1）。其中，病毒引起的葉片皺縮畸形、褪綠癥狀較為普遍。由于有些病毒侵染植物后不表現(xiàn)癥狀，為潛隱性危害，必須通過采樣進(jìn)行病毒檢測(cè)來進(jìn)一步明確櫻桃病毒病的發(fā)生情況。

圖1 被病毒侵染的櫻桃葉片癥狀Fig.1 The symptoms of cherry leaves infected by virus

2.2 侵染櫻桃的幾種病毒的RT-PCR檢測(cè)及分析

對(duì)山東泰安、遼寧大連和北京的20份櫻桃樣品進(jìn)行12種櫻桃病毒的RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：從泰安、大連和北京的12份樣品（DL-3、DL-4、DL-5、DL-6、DL-7、DL-9、TA-10、TA-11、TA-12、BJ-14、BJ-17、BJ-18）中擴(kuò)增出652 bp大小的CVA基因組基因（GenBank登錄號(hào)：NC-003689）部分片段（圖2a）；其檢出率最高，達(dá)60%；從大連和北京的7份樣品（DL-1、DL-4、DL-9、BJ-14、BJ-15、BJ-16、BJ-17）中擴(kuò)增到691 bp大小的PNRSV的CP基因片段（圖2c），檢出率為35%，僅次于CVA；有3份樣品（DL-6、DL-7、BJ-18）擴(kuò)增到304 bp大小的PDV基因組（GenBank登錄號(hào)：NC-008038）CP基因的片段（圖2b），檢出率為15%；BJ-16、BJ-20樣品擴(kuò)增到195 bp的PBNSPaV的CP基因片段（圖2d），檢出率為10%；而來自大連的‘美早’（DL-2，從河北引種）中同時(shí)檢測(cè)到300 bp的LCh V-1的復(fù)制酶基因片段（圖2e）和363 bp的CGRMV的RNA解旋酶基因片段（圖2f），檢出率各為5%。20份樣品中均未檢測(cè)到CRLV、ACLSV、Ap MV、CMV、CNRMV、LCh V-2等6種病毒（表3），而CVA與PDV、CVA與PNRSV、RNRSV與PBNSPaV，LCh V-1與CGRMV存在復(fù)合侵染現(xiàn)象。

表3 櫻桃樣品病毒的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Table 3 Virus infection in cherry orchards based on RT-PCR analysis

為進(jìn)一步驗(yàn)證RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的可靠性，分別對(duì)CVA、PDV、PNRSV、PBNSPaV和LChV-1的PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序，并與GenBank中注冊(cè)的相關(guān)病毒的核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，擴(kuò)增出的CVA、PDV、PNRSV、PBNSPaV、CGRMV和LChV-1片段分別與登錄號(hào)為X82547.1、GU066793.1、 KF135203.1、KJ792822.1、HQ539657.1和D659615.1相應(yīng)片段的核苷酸序列一致性最高，分別為98%、98%、99%、99%、99%和98%。擴(kuò)增出的300 bp大小的LCh V-1，與GenBank中注冊(cè)的其他LChV-1復(fù)制酶基因核苷酸序列一致性為96%～98%，這是在我國(guó)首次檢測(cè)到LChV-1。

圖2 櫻桃病毒RT-PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖譜Fig.2 Electrophoresis assay of RT-PCR products of cherry viruses

3 討論

由于近年來櫻桃栽培在我國(guó)發(fā)展較快，栽培面積不斷擴(kuò)大以及栽培中的苗木引種和調(diào)運(yùn)、無性繁殖代數(shù)增多等因素，加快了櫻桃病毒病的傳播。目前，櫻桃病毒病在我國(guó)已經(jīng)廣泛發(fā)生。

在已報(bào)道檢出的11種櫻桃病毒中，PNRSV、PDV和CVA在我國(guó)發(fā)生較為普遍。在我國(guó)大連、北京和山東等地櫻桃上檢測(cè)到PNRSV和PDV感病植株，其中山東地區(qū)甜櫻桃上PNRSV感染率為38%［17-18］。王文文等于2013年對(duì)山東和遼寧地區(qū)甜櫻桃‘紅燈’進(jìn)行了CVA、LCh V-2和LCh V-1的調(diào)查，結(jié)果表明，CVA、LCh V-2的檢出率較高，分別為60.8%和43.1%，未檢測(cè)到LChV-1［19］。作者對(duì)大連、北京和山東三地的‘紅燈’、‘紅艷’、‘拉賓斯’等多個(gè)櫻桃品種進(jìn)行田間病毒病調(diào)查和采樣檢測(cè)，PNRSV的總檢出率為35%，PDV的總檢出率為15%，CVA的總檢出率為60%，PDV、PNRSV引起了田間櫻桃葉片褪綠斑駁、花葉、葉片細(xì)長(zhǎng)畸形、植株矮縮等癥狀，與已報(bào)道結(jié)果基本一致；可能是由于檢測(cè)的‘紅燈’占檢測(cè)樣品總數(shù)的比例不大，未檢測(cè)到LCh V-2。櫻桃小果?。╨ittle cherry disease，LChD）主要與長(zhǎng)線形病毒科（Closteroviridae）的兩個(gè)成員LCh V-1、LCh V-2有關(guān)，LCh V-2屬于長(zhǎng)線形病毒科的葡萄卷葉病毒屬（Ampelovirus），而LCh V-1屬于長(zhǎng)線形病毒科的尚未定名的病毒種。在意大利、美國(guó)等國(guó)家已報(bào)道檢測(cè)到LChV-1［13］，本研究在遼寧大連櫻桃苗木‘美早’（從河北引種）中檢測(cè)到LCh V-1，并且檢測(cè)到與CGRMV復(fù)合侵染同一植株，這是在我國(guó)首次檢測(cè)到LCh V-1，因此應(yīng)加強(qiáng)我國(guó)櫻桃病毒的檢測(cè)預(yù)防工作，防止新病毒在我國(guó)的傳播和流行。

已有報(bào)道CVA為潛隱性危害，本文檢測(cè)結(jié)果表明該病毒發(fā)生普遍，在未表現(xiàn)癥狀和有縮葉畸形癥狀的葉片中均檢測(cè)到CVA，并在一些樣品中檢測(cè)到CVA與PDV、CVA與PNRSV的復(fù)合侵染，使癥狀表現(xiàn)較為復(fù)雜。觀察到的癥狀與CVA的關(guān)系有待進(jìn)一步研究確定，如，表現(xiàn)的癥狀是否與CVA的潛伏期有關(guān)，是否與存在不同株系有關(guān)，是否還存在其他未知櫻桃病毒與CVA的復(fù)合侵染，有待進(jìn)一步深入的研究。

本研究對(duì)我國(guó)環(huán)渤海地區(qū)的山東泰安、遼寧大連和北京樣品同時(shí)進(jìn)行了12種病毒的系統(tǒng)檢測(cè)，為了解病毒病的發(fā)生情況和病原鑒定提供了更加全面的依據(jù)。由于檢測(cè)的病毒較多，在RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄中用Oligo-d T和隨機(jī)六聚體引物混合檢測(cè)，不僅提高逆轉(zhuǎn)錄的效率，同時(shí)，一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄樣品可用于幾種病毒的檢測(cè)，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間和成本。

目前，對(duì)櫻桃病毒病的防治尚無有效的化學(xué)藥劑，建立快速有效的檢測(cè)方法，加強(qiáng)對(duì)我國(guó)櫻桃病毒病的發(fā)生種類、分布和危害的調(diào)查，加強(qiáng)對(duì)櫻桃苗木引種和調(diào)運(yùn)過程中的病原檢疫檢測(cè)工作，加快櫻桃脫毒優(yōu)良品種的培育，建立無病毒苗木良種繁育體系，對(duì)控制我國(guó)櫻桃病毒病的傳播和櫻桃病毒病的及時(shí)防治具有重要意義。

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Preliminary investigation on cherry virus diseases and detection of the pathogens in some regions of China

Lu Meiguang， Wu Bing， Gao Rui， Zhang Zhixiang， Xiao Hong， Chen Ranran， Li Shifang
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China）

Virus diseases were investigated in some orchards or cultivated areas in Shandong，Liaoning provinces and Beijing of China.The symptoms mainly included leaves shrivel，deformity，roll leaf，yellow and green mottle，plant dwarf，etc.Twenty leaves or stems samples were collected from these orchards.A protocol of RT-PCR was used for the detection of 12 viruses infecting cherry.RT-PCR amplification and sequence analysis showed that amplified products with the expected sizes ofCherry virus A（CVA），Prunus necrotic ringspot virus（PNRSV），Prune dwarf virus（PDV），Plum bark necrosis stem pitting-associated virus（PBNSPaV），Cherry green ring mottle virus（CGRMV）andLittle cherry virus-1（LCh V-1）were obtained.The amplified fragments had high identity with the corresponding nucleotide sequence reported in GenBank.CVA positive samples were detected in samples from Dalian，Liaoning Province，Taian，Shandong Province and Beijing.PNRSV and PDV positive samples were detected in Dalian and Beijing.PBNSPa V positive samples were detected in Beijing.CGRMV and LCh V-1 positive sample were detected in Dalian and this is the first report on the dectetion of LCh V-1 in cherry in China.

cherry； virus diseases； pathogens detection； LCh V-1

S 436.629

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.019

2014 08 19

2014 10 17

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203076）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31471752）

致 謝：感謝大連市農(nóng)科院果樹研究所關(guān)海春研究員；山東農(nóng)業(yè)大學(xué)彭福田教授和山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所張安寧副研究員在采集樣品中提供的幫助。

*通信作者 E-mail：sfli@ippcaas.cn