王 寧， 李景富， 李會(huì)佳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄抗黃化曲葉病基因Ty-2的分子標(biāo)記及種質(zhì)資源初步鑒定

王 寧， 李景富*， 李會(huì)佳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

以抗番茄黃化曲葉病毒病材料‘CLN2498D’為父本，感病材料‘早粉2號(hào)’為母本，以其F2代為研究對(duì)象，采用AFLP及SSR兩種標(biāo)記方法，篩選與Ty-2基因連鎖的標(biāo)記。通過對(duì)256對(duì)AFLP引物及30對(duì)SSR引物的篩選，共獲得5個(gè)AFLP標(biāo)記和2個(gè)SSR標(biāo)記與Ty-2基因連鎖，其中標(biāo)記E02M11距離目標(biāo)基因5.8 c M，另有3個(gè)標(biāo)記距離均在10 c M以內(nèi)。將標(biāo)記E02M11用于30份番茄材料的種質(zhì)資源篩選，獲得12個(gè)含有該標(biāo)記的番茄材料，為番茄抗黃化曲葉病毒育種工作提供基礎(chǔ)。

番茄黃化曲葉病毒；Ty-2； 分子標(biāo)記； 種質(zhì)資源鑒定

番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），通過煙粉虱（Bemisia tabaci）進(jìn)行傳播［1］，國際病毒分類委員會(huì)將其分為TYLCV、TYLCAx V、TYLCCNV、TYLCGu V、TYLCIDV、TYLCKaV、TYLCMaIV、TYLCMLV、TYLCSV、TYLCTHV、TYLCVNV，同時(shí)每種病毒又包含不同株系。這些病毒均能引起番茄黃化曲葉病毒病。

番茄對(duì)該病毒的抗性基因已報(bào)道的共有5個(gè)，

分別被命名為Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和Ty-5。這些抗性基因逐步被科學(xué)家采用多種方法進(jìn)行定位。

Ty-1基因來自于智利番茄‘LA1969’。Zamir等人［2］將該基因定位在番茄的6號(hào)染色體RFLP標(biāo)記TG297（4.0 c M）和TG97（8.6 c M）之間，與標(biāo)記TG97緊密連鎖；Ty-3基因及其等位基因Ty-3a分別來自于智利番茄‘LA2779’和‘LA1932’。Ji等將Ty-3基因定位到第6號(hào)染色體長臂上，在cLEG-31-P16（20 c M）和T1079（27 c M）之間，距離Ty-1位點(diǎn)大約20 cM［3］；Ty-4基因來自于智利番茄‘LA1932’。Ji在智利番茄‘LA1932’中獲得一個(gè)新的菜豆金黃花葉病毒的抗性位點(diǎn)，將其命名為Ty-4，并將其定位在3號(hào)染色體上［4］；Ty-5基因來自于秘魯番茄‘TY172’。Anbinder等［5］將其定位在第4條染色體上。

本試驗(yàn)研究的Ty-2基因來自于多毛番茄‘B6013’。Hanson等發(fā)現(xiàn)抗病材料‘H24’僅在11號(hào)染色體長臂末端TG36（84 c M）到TG393（103 c M）處含有抗性滲透片段，將其命名為Ty-2基因［6］。本試驗(yàn)在分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上，利用篩選出的引物進(jìn)行番茄種質(zhì)資源的鑒定和篩選，旨在為番茄抗黃化曲葉病毒病的育種工作提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用抗病材料‘CLN2498D’（來源于亞洲蔬菜研究與發(fā)展中心）為父本，該材料含有抗病基因Ty-2；選用感病材料‘早粉2號(hào)’（由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育）為母本，該材料不含任何抗番茄黃化曲葉病毒的基因。經(jīng)田間試驗(yàn)，抗病品種與感病品種差異極為明顯。父母本雜交獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代分離群體。選取30份番茄材料用于種質(zhì)資源篩選。以上材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄研究所提供。

番茄黃化曲葉病毒由江蘇省農(nóng)科院提供，通過煙粉虱傳毒，侵染試驗(yàn)材料，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并采集樣本，用于進(jìn)一步研究。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗番茄黃化曲葉病毒病田間抗性鑒定

鑒于我國東北地區(qū)尚未見番茄黃化曲葉病毒病發(fā)病報(bào)道，因此，番茄材料于江蘇省農(nóng)科院種植。為使煙粉虱帶毒，首先對(duì)養(yǎng)蟲室內(nèi)培養(yǎng)的已感染番茄黃化曲葉病毒的番茄材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，確保其已經(jīng)感染番茄黃化曲葉病毒；然后，利用這些已感染病毒的番茄作為食物飼養(yǎng)煙粉虱，使其帶毒；第三，對(duì)煙粉虱進(jìn)行抽樣，使其對(duì)無抗性基因的番茄材料進(jìn)行侵染；最后，對(duì)感病材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，確定其已感染番茄黃化曲葉病毒，從而證明煙粉虱攜帶該病毒。

病毒接種采用網(wǎng)籠接種法。番茄幼苗長至3～4片真葉時(shí)，將其轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)帶毒煙粉虱的網(wǎng)籠中進(jìn)行病毒接種，7 d后噴施殺蟲劑，并將幼苗定植。4周后進(jìn)行田間調(diào)查，記錄番茄發(fā)病情況［7］。參照番茄黃化曲葉病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［8］，將被侵染植株分為0級(jí)至4級(jí)，共5個(gè)級(jí)別。0級(jí)：無明顯癥狀；1級(jí)：葉片只表現(xiàn)有黃色斑點(diǎn)或斑駁癥狀；2級(jí)：葉片黃化，比正常植株略微矮小且輕微變形；3級(jí)：植株矮化，葉片變小、卷曲且邊緣黃化；4級(jí)：植株嚴(yán)重矮化，葉片皺縮、黃化、卷曲并導(dǎo)致葉片面積大大減小。根據(jù)通用的番茄病毒病群體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［9］將各世代的番茄秧苗分為免疫（I，不表現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)為0）、高抗（HR，0＜病情指數(shù)≤2）、抗?。≧，2＜病情指數(shù)≤15）、中抗（MR，15＜病情指數(shù)≤30）、感?。⊿，30＜病情指數(shù)≤100）；并將I、HR、R以及MR歸為抗病，將S歸為感病，然后進(jìn)行抗病性遺傳的適合性測(cè)驗(yàn)，確定抗病親本的抗病性遺傳規(guī)律。

1.2.2 番茄葉片樣本DNA的提取

在F2代發(fā)病高峰期時(shí)，隨機(jī)采集父本、母本及F1代樣本各30株，F(xiàn)2代樣本400株。將各單株分別稱取200 mg幼葉，放入離心管中，液氮迅速冷卻，采用CTAB法［10］提取DNA。提取后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度，并用滅菌去離子水將DNA樣本稀釋為50 ng/μL，于－20℃冰箱中保存，用于AFLP及SSR標(biāo)記。

1.2.3 番茄黃化曲葉病毒抗感池的建立

根據(jù)田間發(fā)病情況，在F2代中，隨機(jī)選取抗病材料20株，感病材料20株，利用BSA法［11］建立抗病池和感病池，用以進(jìn)一步篩選引物。

1.2.4 AFLP分子標(biāo)記

AFLP標(biāo)記方法主要參考Vos等［12］的研究報(bào)道，樣本DNA采用EcoRⅠ和MseⅠ進(jìn)行酶切，酶切連接體系為：DNA 6.0μL，EcoRⅠ（10 U/μL）0.5μL，MseⅠ（10 U/μL）0.5μL，EcoRⅠadapter（5 pmol/ μL）1.0μL，MseⅠadapter（50 pmol/μL）1.0μL，ATP（10 mmol/L）1.0μL，10×buffer 6.0μL，T4 DNA Ligase（5 U/μL）0.6μL，加dd H2O至50μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃酶切與連接6 h。

預(yù)擴(kuò)增體系為：酶切連接后的DNA 6.0μL，EcoRⅠ-primer 0.6μL，MseⅠ-primer 0.6μL，TaqMaster Mix 8.0μL，加dd H2O至25μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，24個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃終止反應(yīng)。取5μL預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物和1μL上樣緩沖液混合，于1%瓊脂糖凝膠中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，依據(jù)條帶清晰度情況，確定將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋40倍為最佳，用于選擇性擴(kuò)增，其余預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物于－20℃保存。

選擇性擴(kuò)增體系為：預(yù)擴(kuò)增稀釋后DNA 6.0μL，所有可被EcoR I進(jìn)行酶切消化的引物（50 ng/μL）1.0μL，所有可被MseI進(jìn)行酶切消化的引物（50 ng/ μL）1.0μL，TaqMaster Mix 8.0μL，加dd H2O至25μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃3 min；94℃30 s，65℃30 s，（每個(gè)循環(huán)降低0.7℃），72℃1 min，12個(gè)循環(huán)；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，25個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)增加1 s）；72℃10 min；4℃終止反應(yīng)。將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在PCR儀中95℃變性5 min后立即置于冰水混合物中，用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離變性產(chǎn)物，參照Bassam等［13］的方法銀染和分析。

1.2.5 SSR分子標(biāo)記

SSR標(biāo)記反應(yīng)體系為20μL，其中，上、下游引物各1μL，DNA（提取后的DNA稀釋40倍）2μL，TaqMaster Mix 8.5μL，加dd H2O至20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃終止反應(yīng)。

產(chǎn)物用95℃變性5 min，之后立即放入冰水混合物中，用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離變性產(chǎn)物，參照Bassam等［13］的方法銀染后進(jìn)行分析。

1.2.6 種質(zhì)資源的篩選

利用E02M11標(biāo)記對(duì)30份番茄材料進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定，為進(jìn)一步研究抗黃化曲葉病毒品種提供育種材料。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳規(guī)律分析

對(duì)父本、母本、F1及F2代分離群體進(jìn)行田間抗性鑒定。父本共126株均為抗病，母本共418株均為感病，F(xiàn)1代172株均為抗病，F(xiàn)2代共954株，其中721株表現(xiàn)為抗病，233株表現(xiàn)為感病，F(xiàn)2群體基本符合3∶1的分離規(guī)律，因此確定抗番茄黃化曲葉病毒的Ty-2基因?yàn)轱@性單基因控制。

表1 不同世代材料Ty-2基因抗病性遺傳分析Table 1 Genetic analysis ofTy-2 disease-resistance in different generations

2.2 AFLP引物的篩選及分析

用親本‘CLN2498D’及‘早粉2號(hào)’對(duì)256對(duì)AFLP選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行篩選，獲得差異引物115對(duì)；將篩出的引物通過抗感池進(jìn)行復(fù)選，獲得差異引物31對(duì)；將這些引物通過小群體再次篩選，最終獲得17對(duì)多態(tài)性較好的引物（圖1～3）。

利用篩選出的17對(duì)引物，對(duì)F2代群體共計(jì)387個(gè)DNA樣本進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，利用Map Marker軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算遺傳距離。結(jié)果得到5個(gè)與Ty-2基因相連鎖的標(biāo)記：E02M11、E02M09、E10M11、E02M07和E04M13，遺傳距離分別為5.8、7.7、8.3、10.2、12.7 c M（圖4）。

2.3 SSR引物的篩選及分析

利用親本對(duì)30對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，獲得12對(duì)差異引物，通過抗感池進(jìn)行復(fù)選，獲得5對(duì)多態(tài)性較好的引物（圖5～6）。

利用篩選出的5對(duì)引物，對(duì)F2代群體共計(jì)387個(gè)DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得差異，部分結(jié)果見圖7。利用Map Marker軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算遺傳距離。獲得了2個(gè)與Ty-2基因相連鎖的標(biāo)記：TGS3809和TGS7944，遺傳距離分別為7.9、11.6 c M（圖4）。

圖1 利用親本篩選AFLP引物Fig.1 Screening of AFLP primers using the parents

圖2 利用抗感池篩選AFLP引物Fig.2 Screening of AFLP primers using resistant and susceptible pools

圖3 利用部分小群體篩選AFLP引物Fig.3 Screening of AFLP primers using small groups

圖4 AFLP及SSR各引物遺傳距離Fig.4 Genetic distances between AFLP and SSR primers

2.4 種質(zhì)資源的篩選

為了加快抗番茄黃化曲葉病毒品種的育種進(jìn)程，進(jìn)一步篩選可利用的種質(zhì)資源，同時(shí)，通過材料的田間性狀驗(yàn)證所獲得標(biāo)記是否能夠有效地區(qū)分抗、感材料，本試驗(yàn)選取30份種質(zhì)資源，對(duì)其進(jìn)行田間抗病性鑒定，結(jié)果表明，在30份種質(zhì)資源中田間表現(xiàn)抗病的材料為11份，表現(xiàn)感病的材料為19份；同時(shí)，利用分子標(biāo)記方法，對(duì)該30份材料進(jìn)行分子標(biāo)記，獲得12份含有抗病基因的材料。其中有1份材料（‘13356-1’）含有抗病基因，但在田間發(fā)?。ū?）。

圖5 利用親本篩選SSR引物Fig.5 Screening of SSR primers using the parents

圖6 抗感池篩選SSR引物Fig.6 Screening of SSR primers using resistant and susceptible pools

表2 待鑒定品種分子標(biāo)記與田間表現(xiàn)結(jié)果Table 2 Results of molecular marking and field performance

圖7 SSR引物TGS3809在F2代群體中的分布Fig.7 The distribution of SSR marker TGS3809 in F2generation

3 討論

番茄黃化曲葉病毒病現(xiàn)已成為世界性的番茄病害，在我國發(fā)生廣泛，危害嚴(yán)重。急需抗性材料進(jìn)行抗病育種工作，因此，抗病基因的鑒定顯得尤為重要。本試驗(yàn)通過分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)抗番茄黃化曲葉病基因Ty-2進(jìn)行篩選，旨在找到特定標(biāo)記，縮短育種周期，降低人為因素的干擾，較為直觀地找到差異，從而方便育種工作者更好地選擇育種材料。

本試驗(yàn)通過田間性狀和分子標(biāo)記對(duì)Ty-2基因進(jìn)行檢測(cè)，獲得較為可靠的連鎖標(biāo)記。經(jīng)田間性狀分析，F(xiàn)2代抗感分離比例基本符合3∶1的分離規(guī)律，基本可以確定該抗病基因?yàn)橘|(zhì)量性狀，受單基因控制，且抗病為顯性。

分子標(biāo)記中，AFLP標(biāo)記因其多態(tài)性強(qiáng)，條帶豐富，標(biāo)記清晰，結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用；SSR標(biāo)記則因其簡(jiǎn)單、快速、需要DNA質(zhì)量較低，且成本低廉等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于育種工作中。本試驗(yàn)通過AFLP標(biāo)記和SSR標(biāo)記共獲得7個(gè)（5個(gè)AFLP標(biāo)記和2個(gè)SSR標(biāo)記）與Ty-2基因連鎖的分子標(biāo)記，其中AFLP標(biāo)記中E02M11與Ty-2的連鎖距離為5.8 cM。利用該標(biāo)記對(duì)387份F2代分離群體進(jìn)行鑒定后，與田間性狀對(duì)比，吻合率為87.08%。在F2代分離群體及30份待檢種質(zhì)資源中均有田間表現(xiàn)為抗病，但未擴(kuò)增出特異性條帶的情況，這可能與該標(biāo)記與目的基因連鎖不夠緊密有關(guān)，但同時(shí)，也可能存在其他基因，對(duì)番茄黃化曲葉病毒病具有一定抑制作用。將該標(biāo)記用于30份材料的種質(zhì)資源篩選，篩選出12份具有標(biāo)記的材料，其中11份田間表現(xiàn)也為抗病，為進(jìn)一步育成抗病材料提供了寶貴的種質(zhì)資源。

本試驗(yàn)中，共獲得了5對(duì)AFLP標(biāo)記和2對(duì) SSR標(biāo)記，其中1對(duì)連鎖距離較近，但在鑒定過程中，分子標(biāo)記與田間性狀有一定差異，因此，需要進(jìn)一步開發(fā)吻合率更高的標(biāo)記，為番茄抗黃化曲葉病毒病的育種工作奠定基礎(chǔ)。

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Screening of molecular markers linked toTomato yellow leaf curl virusresistant geneTy-2 in tomatoes and identification of germplasm resources

Wang Ning， Li Jingfu， Li Huijia
（College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin150030，China）

Using the resistant strain‘CLN2498D’toTomato yellow leaf curl virusas male parent and the susceptible cultivar‘Zaofen 2’as female parent，the F2generation was studied with AFLP and SSR markers linked withTy-2 gene.Through the screening of 256 pairs of AFLP primers and 30 pairs of SSR primers，five AFLP markers and two SSR markers were found to be linked toTy-2 gene.The marker E02M11was 5.8 c M away from the target gene，and the other 3 markers were within 10 c M range.E02M11was then used for germplasm screening，and 12 tomato materials were shown to contain the marker，which provide the basis for breeding tomato varieties resistant toTomato yellow leaf curl virus.

Tomato yellow leaf curl virus；Ty-2； genetic marker； identification of germplasm resource

S 436.412.11

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.015

2014 01 23

2014 04 02

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD02B02 7）

*通信作者 E-mail：lijf＿2005@126.com