王世強(qiáng)，常 蕓，馬曉雯，饒志堅(jiān)

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不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心房TGF-β1/miR-21信號(hào)途徑的影響

王世強(qiáng)1,2，常 蕓1，馬曉雯1，饒志堅(jiān)1,2

目的：通過建立長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)動(dòng)物模型，研究不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心房羥脯氨酸含量的影響以及TGF-β1/miR-21信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)作用，為運(yùn)動(dòng)性心房纖顫的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：72只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為安靜組、中等強(qiáng)度組和大強(qiáng)度組，每組24只。分別進(jìn)行8周、12周和16周運(yùn)動(dòng)，每周訓(xùn)練5天，休息2天，每次運(yùn)動(dòng)1 h。運(yùn)動(dòng)8周、12周和16周后24 h內(nèi)處死取材摘取心臟，分離出右心房。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清cTnI的含量；樣本堿水解法檢測(cè)羥脯氨酸的含量；熒光定量PCR檢測(cè)TGF-β1和miR-21的含量。Western Blot檢測(cè)TGF-β1蛋白表達(dá)。結(jié)果：大強(qiáng)度組8周、12周和16周大鼠血清cTnI的含量均顯著高于安靜組和中等強(qiáng)度組(P<0.01)，中等強(qiáng)度組8周、12周和16周大鼠cTnI的含量均無顯著變化。8周運(yùn)動(dòng)后，各組之間羥脯氨酸的含量無明顯差異；12周和16周大強(qiáng)度組羥脯氨酸的含量顯著高于各自的安靜組和中等強(qiáng)度組(P<0.01)，中等強(qiáng)度組和安靜組之間沒有顯著性差異。隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長，大強(qiáng)度組羥脯氨酸的含量有逐漸增加趨勢(shì)，16周羥脯氨酸的含量顯著高于8周大強(qiáng)度組(P<0.05)。8周、12周和16周大強(qiáng)度組TGF-β1基因和蛋白的表達(dá)均顯著高于各自安靜組，而中等強(qiáng)度組和安靜組之間TGF-β1的表達(dá)無明顯差異。隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長，大強(qiáng)度組TGF-β1的含量有逐漸降低的趨勢(shì)。8周、12周和16周運(yùn)動(dòng)后，與各自安靜組相比，大強(qiáng)度組miR-21的表達(dá)均顯著性增加(P<0.05)，隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長，大強(qiáng)度組miR-21的含量有逐漸降低的趨勢(shì)，16周大強(qiáng)度組miR-21的表達(dá)顯著低于8周大強(qiáng)度組(P<0.05)，中等強(qiáng)度組和安靜組之間miR-21的表達(dá)無明顯差異。結(jié)論：長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠心肌損傷長期存在，并伴隨大鼠心房膠原蛋白的持續(xù)增加，誘發(fā)了心房纖維化，構(gòu)成了運(yùn)動(dòng)性心房纖顫的病理基礎(chǔ)。長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)通過上調(diào)大鼠心房TGF-β1/miR-21信號(hào)通路，可能介導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)性心房損傷纖維化的發(fā)生。

運(yùn)動(dòng)；鼠；心房纖維化；羥脯氨酸；轉(zhuǎn)化生長因子；microRNA-21

有流行病學(xué)研究表明，長期從事耐力運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員心房纖顫(房顫)的發(fā)生率明顯高于其他項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員[2,3]。有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，耐力運(yùn)動(dòng)員房顫的發(fā)生率在0.3%～12.8%之間，遠(yuǎn)高于正常人群[49]。研究發(fā)現(xiàn)，耐力運(yùn)動(dòng)員房顫的發(fā)生與從事大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的累積時(shí)間呈正相關(guān)[36]。以往多數(shù)研究認(rèn)為，長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成的炎癥反應(yīng)、心房擴(kuò)張、自主神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生變化和電解質(zhì)紊亂是造成房顫的重要發(fā)生機(jī)制[39,44,50]。近年的一些研究證實(shí)，長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成心肌損傷并持續(xù)存在，最終導(dǎo)致心房纖維化，可能是房顫發(fā)生的重要病理變化[9,12,19,21]。有研究通過天狼星紅染色也發(fā)現(xiàn)，12周的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠心房發(fā)生纖維化，且隨時(shí)間延長，纖維化的程度逐漸增高[5]。

心房纖維化是指心房中的膠原纖維異常增加的現(xiàn)象。過度增加的膠原纖維影響心肌細(xì)胞間的電信號(hào)傳導(dǎo)，促使房顫的發(fā)生與維持[25]。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在炎癥和組織修復(fù)等方面具有重要作用，是最主要的促纖維化調(diào)節(jié)因子[52]。TGF-β1可通過促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，使成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)(主要為膠原蛋白)的合成能力增強(qiáng)，最終造成心肌纖維化的發(fā)生[38]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21介導(dǎo)了TGF-β1誘導(dǎo)的炎癥和損傷后纖維化的發(fā)生過程[18]。Yao等發(fā)現(xiàn)，miR-21促進(jìn)心肌組織中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，參與調(diào)節(jié)了TGF-β1誘導(dǎo)的心肌纖維化的發(fā)生過程[53]。目前，關(guān)于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì)心房TGF-β1/miR-21信號(hào)途徑的影響尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬通過觀察不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間對(duì)心房TGF-β1和miR-21的影響，探討其在運(yùn)動(dòng)性心房纖維化中的作用，為研究運(yùn)動(dòng)性心房纖顫的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為篩選安全有效的預(yù)防和治療運(yùn)動(dòng)性心房纖顫的有效治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠72只，體重為(220±8 g)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXX(京)2012-0001。所有大鼠均以嚙齒類動(dòng)物普通飼料喂養(yǎng)，在國家體育總局體育科學(xué)研究所ABSL-3級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，室溫為22±2℃，空氣濕度為45%～55%，每天光照12 h。

1.2 分組和運(yùn)動(dòng)方案

1.3 取材

大鼠運(yùn)動(dòng)8周、12周和16周后24 h內(nèi)進(jìn)行取材。迅速取出心臟，切取右心房，每塊組織分為2份，其中1份用于羥脯氨酸含量的檢測(cè)，另1份放入-80℃冰箱用于做RT-PCR和Western blot。

1.4 Elisa檢測(cè)血清cTnI的含量

采用雙抗體夾心法，大鼠cTnI單抗包被在96孔酶標(biāo)板內(nèi)，依次加入HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的二抗、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品，經(jīng)溫育形成抗原-抗體反應(yīng)體系與過氧化物酶復(fù)合物并經(jīng)過洗滌后，加入底物TMB顯色，顏色呈藍(lán)色，最后加入終止液后，液體顏色呈現(xiàn)黃色。樣品中cTnI的濃度與顏色的深淺呈正相關(guān)。在Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)450色nm處測(cè)定OD值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出血清中cTnI的濃度。Elisa試劑盒購于Life Diagnostics公司。

1.5 羥脯氨酸含量的檢測(cè)(樣本堿水解法)

羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈紫色，根據(jù)其呈色的深淺可推算其含量。稱量組織放入試管中，加入水解液，混勻，加蓋后95℃或者沸水浴水解20 min。調(diào)pH值至6.0～6.8，加入雙蒸水，混勻，加入適量活性炭，混勻。按表1添加完3種試劑后，60℃水浴15 min，冷卻后3 500 r/min離心10 min，取上清在波長550 nm處測(cè)定各管吸光度值。試劑盒購于南京建成生物工程研究所(貨號(hào)A030-2)。

表1 本研究Hyp含量測(cè)定操作一覽表

Table 1 Schedule Table of Determination of Hyp Content

空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管雙蒸水1ml標(biāo)準(zhǔn)液1ml檢測(cè)液1ml試劑1試劑20.5ml0.5ml(混勻,靜置10min)0.5ml試劑30.5ml0.5ml(混勻,靜置10min)0.5ml

計(jì)算公式：

1.6 RT-PCR檢測(cè)TGF-β1 mRNA的表達(dá)

采用Trizol法(購于美國Technologies)提取總RNA，每個(gè)樣本按照2 μg RNA作為初始模板，配置20 μl的總反應(yīng)體系，應(yīng)用cDNA合成試劑盒(RR370A，購于TaKaRa公司)在核酸擴(kuò)增儀(Gene Amp PCR System 9700，美國ABI公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：37℃，15min；85℃ 5s；4℃保持。以合成的cDNA作為模板，以β-actin作為內(nèi)參，配置20 μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(7300，美國ABI)進(jìn)行擴(kuò)增熒光定量，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，30 s；PCR反應(yīng)95℃，5 s；60℃，31 s；40個(gè)循環(huán)。熒光定量試劑盒為TaKaRa公司的RR820A。根據(jù)收集的數(shù)據(jù)通過2-△△CT公式計(jì)算樣本中mRNA的相對(duì)含量，其中△△CT=(CT實(shí)驗(yàn)組目的基因-CT實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)-(CT對(duì)照組目的基因-CT對(duì)照組內(nèi)參基因)。實(shí)驗(yàn)所需引物由上海生工生物合成。

1.7 RT-PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)

采用Trizol法(購于美國Technologies)提取總RNA，每個(gè)樣本按照2 μg RNA作為初始模板，配置20 μl的總反應(yīng)體系，采用在miRNA3′末端加多聚A尾Poly(A)，再使用Oligo(dT)-univerl tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以合成的cDNA為模板，以U6作為內(nèi)參基因，配置20 μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增熒光定量，反應(yīng)條件為：94℃，2 min，起始模板變性；94℃，20 s，PCR循環(huán)中模板變性，60℃，34 s，退火、延伸，40個(gè)循環(huán)。反轉(zhuǎn)錄、熒光定量試劑盒和miRNA引物均購于天根生化科技(北京)有限公司。根據(jù)收集的數(shù)據(jù)通過2-△△CT公式計(jì)算樣本中miRNA的相對(duì)含量。

表2 本研究RT-PCR檢測(cè)TGF-β1引物序列一覽表

Table 2 Primer Sequence of TGF-β1 Detection by RT-PCR

引物序列長度β-actin上游引物5'-CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3'105bp下游引物5'-GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3'TGF-β1上游引物5'-ATTCCTGGCGTTACCTTGG-3'120bp下游引物5'-AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3'

表3 本研究Real-time PCR檢測(cè)miR-21引物序列一覽表

Table 3 Primer Sequence of miR-21 Detection by RT-PCR

引物序列長度U6上游引物5'-CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3'105bpmiR-21上游引物5'-ATTCCTGGCGTTACCTTGG-3'120bp

1.8 Western Blot法檢測(cè)心房TGF-β1的蛋白表達(dá)

提取總蛋白后用BCA法測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度一致后，加入上樣緩沖液沸水中10 min使蛋白變性。120 V恒壓SDS-PAGE電泳1 h后，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉(購于美國BD公司)封閉1 h，一抗(Anti-TGF-β1，內(nèi)參為β-actin,購于美國Abcam公司)置于搖床4℃過夜。TBST洗滌3次后，加HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000，購于北京欣博盛公司)，室溫?fù)u床孵育1 h。TBST洗膜3次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑(購于美國Millipore)，室溫靜置2 min，濾紙吸干后置于保鮮膜內(nèi)封存，置于暗匣內(nèi)，X光片曝光約1 min，顯影液中顯影2 min，定影數(shù)十秒，條帶用Quntity One軟件進(jìn)行圖像分析。計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的積分光密度(IOD)的相對(duì)值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠血清cTnI的含量變化

結(jié)果如表4所示，與安靜組相比，中等強(qiáng)度組8周、12周和16周大鼠cTnI的含量均無顯著變化。而大強(qiáng)度組8周、12周和16周cTnI的含量均顯著高于安靜組和中等強(qiáng)度組(P<0.01)。不同時(shí)間各運(yùn)動(dòng)組之間無明顯差異。

表4 本研究大鼠血清cTnI含量的變化一覽表

Table 4 Change of Serum cTnI of Rats(ng/ml)

安靜組中等強(qiáng)度組大強(qiáng)度組8周0.66±0.110.71±0.181.14±0.25*#12周0.68±0.150.65±0.121.42±0.26*#16周0.61±0.070.70±0.171.32±0.33*#

注：*表示P<0.05，與安靜組相比；#表示P<0.05，與中強(qiáng)度組相比。

2.2 大鼠心房羥脯氨酸的含量變化

羥脯氨酸含量測(cè)量結(jié)果如圖1所示，8周運(yùn)動(dòng)后，各組之間羥脯氨酸含量無明顯改變。12周和16周大強(qiáng)度組羥脯氨酸含量顯著高于各自的安靜組和中等強(qiáng)度組(P<0.01)，中等強(qiáng)度組和安靜組之間沒有顯著性差異。大強(qiáng)度組大強(qiáng)度組之間通過比較發(fā)現(xiàn)，8周、12周和16周大強(qiáng)度組羥脯氨酸含量逐漸增加，16周羥脯氨酸含量顯著高于8周大強(qiáng)度組(P<0.05)。

圖1 本研究心房羥脯氨酸的含量示意圖

注：**P<0.01，與各自安靜組相比；##P<0.05，與各自中強(qiáng)度組相比；&P<0.05，與8周大強(qiáng)度組相比。

2.3 大鼠心房TGF-β1 mRNA的表達(dá)變化

熒光定量PCR結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過8周、12周和16周運(yùn)動(dòng)后，大強(qiáng)度組TGF-β1 mRNA含量均高于各自安靜組和中等強(qiáng)度組，和各自安靜組相比，均具有顯著性差異(P<0.05)，中等強(qiáng)度組TGF-β1 mRNA的含量也高于各自安靜組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

通過計(jì)算比較8周、12周和16周大強(qiáng)度組之間TGF-β1 mRNA的相對(duì)含量變化發(fā)現(xiàn)，12周和16周TGF-β1 mRNA的含量均顯著低于8周大強(qiáng)度組(P<0.05)，12周和16周之間無明顯差異(圖3)。

圖2 本研究心房TGF-β1 mRNA的相對(duì)含量示意圖

圖3 本研究大強(qiáng)度組心房 TGF-β1 mRNA的相對(duì)含量示意圖

2.4 大鼠心房TGF-β1 蛋白的表達(dá)變化

Western Blot結(jié)果如圖4所示，8周運(yùn)動(dòng)后大強(qiáng)度組TGF-β1含量顯著高于安靜組和中等強(qiáng)度組(P<0.01)。中等強(qiáng)度組TGF-β1的表達(dá)低于安靜組，但無顯著性差異；12周大強(qiáng)度組TGF-β1的含量顯著高于安靜組和中等強(qiáng)度組(P<0.05)，中等強(qiáng)度組TGF-β1的含量高于安靜組，無顯著性差異；16周大強(qiáng)度組TGF-β1的含量顯著高于安靜組和中等強(qiáng)度組(P<0.05)，中等強(qiáng)度組TGF-β1的含量略低于安靜組，但無顯著性差異。進(jìn)一步比較各訓(xùn)練周長之間大強(qiáng)度組TGF-β1 蛋白的含量發(fā)現(xiàn)，TGF-β1蛋白含量逐漸降低，12周和16周大強(qiáng)度組TGF-β1蛋白含量均顯著低于8周大強(qiáng)度組，12周和16周之間無明顯差異。

2.5 大鼠心房miR-21的表達(dá)變化

如圖5所示，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，8周運(yùn)動(dòng)后，和安靜組相比，大強(qiáng)度組miR-21的表達(dá)增加3.29倍(P<0.05)，中等強(qiáng)度組增加0.45倍，但無顯著性差異；12周運(yùn)動(dòng)后，和安靜組相比，大強(qiáng)度組miR-21的表達(dá)增加2.58倍(P<0.05)，中等強(qiáng)度組增加0.16倍，但無顯著性差異；16周運(yùn)動(dòng)后，和安靜組相比，大強(qiáng)度組增加3.67倍(P<0.05)，中等強(qiáng)度組miR-21的表達(dá)增加1.2倍，但無顯著性差異。

圖4 本研究心房TGF-β1蛋白的含量變化示意圖

注：*P<0.05，**P<0.01，與各自安靜組相比；#P<0.05，##P<0.01，與各自中等強(qiáng)度組相比；&P<0.05，&&P<0.01，與8周大強(qiáng)度組相比。

如圖6所示，進(jìn)一步比較8周、12周和16周大強(qiáng)度組之間miR-21的相對(duì)含量變化發(fā)現(xiàn)，miR-21的含量有逐漸降低的趨勢(shì)，16周大強(qiáng)度組miR-21的表達(dá)顯著低于8周大強(qiáng)度組(P<0.05)。

圖5 本研究心房miR-21的相對(duì)含量變化示意圖

注：*P<0.01，與各自安靜組相比；#P<0.05，與各自中等強(qiáng)度組相比。

圖6 本研究大強(qiáng)度組心房miR-21的相對(duì)含量示意圖

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動(dòng)性心肌損傷、心房纖維化與房顫的研究

適當(dāng)強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)可以降低心血管疾病的發(fā)病率，延長壽命，已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可[41]。但不可忽視的是，長期從事高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的耐力運(yùn)動(dòng)員心律失常的發(fā)生率顯著高于正常人群，由于其影響到運(yùn)動(dòng)員的身體健康、系統(tǒng)訓(xùn)練以及比賽成績(jī)，并且耐力項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員和從事過大強(qiáng)度與大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)員可出現(xiàn)嚴(yán)重的心律失常，甚至發(fā)生運(yùn)動(dòng)性猝死[1]。其中，運(yùn)動(dòng)員房顫和心房撲動(dòng)的發(fā)生率較為顯著[13,34]。Abdulla等曾調(diào)查研究了655名耐力運(yùn)動(dòng)員(平均年齡為51±9歲)后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)員房顫的發(fā)生率是普通人群的5.29倍[8]。Wernhart等的一項(xiàng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，耐力運(yùn)動(dòng)員孤立性心房纖顫的發(fā)生率在0.3%～12.8%之間，遠(yuǎn)高于正常人群[49]。Molina等調(diào)查了252名男性馬拉松運(yùn)動(dòng)員后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)員孤立性房顫的發(fā)生率顯著高于安靜對(duì)照人群(0.43% vs 0.11%)[33]。有研究報(bào)道，耐力運(yùn)動(dòng)員房顫的發(fā)生率是安靜對(duì)照人群的2～10倍，并且運(yùn)動(dòng)性心房纖顫的發(fā)生與從事大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的累積時(shí)間密切相關(guān)[34，35]。Mystad等通過對(duì)3 545名越野滑雪運(yùn)動(dòng)員的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，12.5%的調(diào)查對(duì)象存在房顫，且其發(fā)生率和累積運(yùn)動(dòng)時(shí)間成正相關(guān)[36]。另有研究報(bào)道，具有長期從事滑雪經(jīng)歷的老齡運(yùn)動(dòng)人群(65～90歲)房顫的發(fā)生率顯著高于普通人群。Elosua等的研究發(fā)現(xiàn)，一生中總的運(yùn)動(dòng)時(shí)間累積超過1 500 h，房顫的易感性顯著增加[17]。

近年研究表明，長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成心房肌炎癥的持續(xù)存在和累積損傷，可誘發(fā)心肌纖維化，可能是運(yùn)動(dòng)性心房纖顫的重要病理機(jī)制。心房纖維化是指心房中的膠原纖維過度增加的現(xiàn)象。膠原纖維對(duì)維持心房肌細(xì)胞正常的生理功能具有重要作用，然而，過度增加的膠原纖維將影響心肌細(xì)胞的電信號(hào)傳導(dǎo)，促使房顫的發(fā)生與維持。Guasch等研究發(fā)現(xiàn)，16周每天進(jìn)行1 h大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的大鼠心房纖維化程度增加60%，房顫的易感性顯著高于安靜對(duì)照組(64% vs 15%)[21]。Benito等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，16周的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心房纖維化相關(guān)因子顯著增加[12]。

羥脯氨酸為膠原纖維所特有，測(cè)定心房羥脯氨酸含量，通過換算可得出膠原蛋白的含量，反映心肌纖維化的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，和安靜組比較，8周大強(qiáng)度組大鼠心房羥脯氨酸含量略有增加，而中等強(qiáng)度組羥脯氨酸含量降低，但均無顯著性差異。12周和16周運(yùn)動(dòng)后，大強(qiáng)度組羥脯氨酸含量均顯著高于安靜組和中等強(qiáng)度組。而中等強(qiáng)度組羥脯氨酸含量也高于安靜組，但兩者之間無明顯差異。通過天狼星紅染色研究發(fā)現(xiàn)，12周和16周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，大鼠心房膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)和Ⅰ型膠原蛋白顯著增加，心房發(fā)生纖維化[5]。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)8周、12周和16周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后大鼠血清cTnI的含量均顯著高于安靜組和中等強(qiáng)度組，而中等強(qiáng)度組和安靜對(duì)照組之間cTnI的含量未有顯著差異。cTnI是心肌特異性和靈敏度較強(qiáng)的一種肌鈣蛋白，已成為檢測(cè)心肌損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究說明，不同周期的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成大鼠心肌損傷持續(xù)存在。而心房肌細(xì)胞內(nèi)肌纖維相對(duì)較少，肌漿網(wǎng)和橫管系統(tǒng)不發(fā)達(dá)且線粒體較少，長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，心房接受回流血量大，產(chǎn)生較大前負(fù)荷，對(duì)氧和能量需求較高，更易發(fā)生缺氧和損傷，細(xì)胞通透性增高，cTnI漏出入血。有學(xué)者研究也發(fā)現(xiàn)，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后大鼠血清cTnI的含量顯著增高，且與運(yùn)動(dòng)性心肌微損傷程度相關(guān)[4,29]。George等通過人體研究也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與cTnI的含量呈正相關(guān)[20]。因此，cTnI可以作為檢測(cè)和監(jiān)控過度運(yùn)動(dòng)時(shí)心肌受損程度的有效指標(biāo)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，羥脯氨酸含量的顯著增加，可能是由于長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后心肌損傷修復(fù)的長期累積所致。與本研究一致，Benito等發(fā)現(xiàn)，16周的大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)了大鼠右心室羥脯氨酸的顯著升高[12]。有文章也表明，6周的大強(qiáng)度游泳和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)造成了小鼠心房纖維化，是房顫易感性增加的重要原因[9]。

3.2 長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)上調(diào)TGF-β1/miR-21信號(hào)通路

研究表明，TGF-β1在調(diào)控炎癥反應(yīng)和損傷后修復(fù)過程中具有重要作用，也是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的促纖維化因子之一，其可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及膠原蛋白的合成促進(jìn)損傷后修復(fù)與纖維化的形成[54]。本研究發(fā)現(xiàn)，8周、12周和16周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，大鼠心房TGF-β1基因和蛋白的表達(dá)均顯著增加，而中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后心房TGF-β1的變化不明顯。這可能是由于大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)心房產(chǎn)生較大的機(jī)械負(fù)荷，造成心房組織中的成纖維細(xì)胞合成分泌較多的TGF-β1，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(主要為膠原蛋白)的合成與分泌增多。適度增多的膠原蛋白對(duì)防止心肌被過度拉伸具有保護(hù)作用，而長期反復(fù)的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成TGF-β1的持續(xù)高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的大量增加，心臟可能由生理性重塑向病理性重塑發(fā)展。過度增加的膠原蛋白誘發(fā)心肌纖維化，影響心臟的收縮和舒張功能以及心肌的順應(yīng)性和僵硬度[42]。在組織損傷早期，TGF-β1的高表達(dá)在對(duì)組織損傷后的修復(fù)具有重要作用。然而，長期持續(xù)TGF-β1的異常表達(dá)反而會(huì)造成組織的過度修復(fù)，損傷部位可能發(fā)生纖維化。與本研究結(jié)果一致，徐明明等研究發(fā)現(xiàn)，急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，大鼠骨骼肌在頓挫傷后修復(fù)過程中TGF-β1的表達(dá)顯著增加[7]。高曉嶙等研究也發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在肌腱過度使用中長期高表達(dá)，可能是肌腱發(fā)生退行性病變的重要病理機(jī)制[6]。Heinemeier等研究也發(fā)現(xiàn)，急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后骨骼肌中TGF-β1 mRNA的表達(dá)也顯著升高[24]。人體實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，耐力運(yùn)動(dòng)后血液里多種炎癥相關(guān)因子表達(dá)增加，TGF-β1的含量也顯著增加，但其是否來自于心肌細(xì)胞的釋放入血，仍需進(jìn)一步研究[14,37]。

研究證實(shí)，劇烈或較大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成活性氧(ROS)的大量增加可上調(diào)TGF-β1的表達(dá)[38]。另外，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后血管緊張素的分泌增加也會(huì)造成TGF-β1的表達(dá)增加[16]。TGF-β1可通過p38MAPK途徑或者激活下游SMAD信號(hào)通路，激活生成膠原纖維的途徑，使成纖維化細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)的合成增加，誘發(fā)心房纖維化[28,51]。有研究也發(fā)現(xiàn)，16周的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，大鼠心房結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)顯著增加[5]。而CTGF是TGF-β1重要的下游作用因子，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，在心房纖維化和心房纖顫的發(fā)生過程中也具有重要作用[30]。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-21介導(dǎo)了TGF-β1的促炎和促纖維化過程。miR-21主要通過調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞的增殖而參與心肌纖維化的過程[27]。研究顯示，在組織器官纖維化病變過程中miR-21表達(dá)顯著增加。Thum等通過原位雜交證實(shí)，心肌的miR-21選擇性的在成纖維細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示，miR-21表達(dá)的上調(diào)，能抑制Spry1的水平，從而增強(qiáng)ERK-MAP信號(hào)通路的活性，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了心肌細(xì)胞纖維化的發(fā)生。在壓力負(fù)荷增加的動(dòng)物模型中，用反義寡核苷酸antagomiRs抑制miR-21，心肌ERK-MAP激酶的活性降低。另外，Roy等在缺血再灌注動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在心肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)升高，磷酸酶張力蛋白(PTEN)表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)而激活磷脂?；?3-激酶(PI3K-Akt)信號(hào)通路[40]。PI3K-Akt通路的活化能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP-2)的活性，從而參與心肌纖維化的調(diào)節(jié)[43]。Ma等研究報(bào)道，8周的游泳訓(xùn)練顯著上調(diào)大鼠左心室miR-21的表達(dá)，通過降解PTEN介導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)性心肌肥大的發(fā)生[31]。但目前不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心房miR-21的影響的研究報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，8周、12周和16周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，心房miR-21的表達(dá)均顯著增加，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，心房miR-21的表達(dá)也具有增加趨勢(shì)，但無顯著性差異。這表明，長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心房纖維化的形成可能與心肌中miR-21的長期高表達(dá)密切相關(guān)。

研究報(bào)道顯示，TGF-β1可通過調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和纖維化的形成。Madhyastha等通過體外研究發(fā)現(xiàn)，在高糖條件下，TGF-β1促進(jìn)了皮膚成纖維細(xì)胞miR-21的表達(dá)[32]。He等發(fā)現(xiàn)在血吸蟲誘導(dǎo)的肝臟纖維化發(fā)生過程中，存在TGF-β1和miR-21的高表達(dá)，體內(nèi)腺病毒轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑可有效抑制肝纖維化的發(fā)展。進(jìn)一步研究則發(fā)現(xiàn)，TGF-β1通過激活SMAD蛋白上調(diào)肝衛(wèi)星細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，而阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路可顯著下調(diào)肝衛(wèi)星細(xì)胞miR-21的表達(dá)[23]。Jiang等發(fā)現(xiàn)，輻射通過激活TGF-β1/miR-21信號(hào)通路，導(dǎo)致ROS增加，進(jìn)而導(dǎo)致肺組織細(xì)胞DNA損傷[26]。Villar等發(fā)現(xiàn)，在壓力負(fù)荷過載小鼠模型中存在TGF-β1和miR-21同時(shí)高表達(dá)的現(xiàn)象[45]。同時(shí)，人體研究也發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈狹窄病人血漿中TGF-β1和miR-21的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照人群，miR-21與心組織切片中膠原的含量呈正相關(guān)。在心肌間質(zhì)細(xì)胞而非心肌細(xì)胞存在miR-21的高表達(dá)[46]。García等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞中，TGF-β1的過表達(dá)通過激活SMAD2/3信號(hào)通路和DICER1共同作用促進(jìn)前體miR-21加工為成熟的miR-21[18]。

有研究發(fā)現(xiàn)，急性力竭運(yùn)動(dòng)和長期耐力運(yùn)動(dòng)能顯著增加人體血液循環(huán)中TGF-β1[22,47]和miR-21[10,15,48]的含量，但其是否來源于心肌組織的釋放入血尚不明確。因此，深入研究運(yùn)動(dòng)與TGF-β1/miR-21的關(guān)系，對(duì)我們深入了解運(yùn)動(dòng)性心律失常的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究對(duì)人類運(yùn)動(dòng)性心律失常的治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施選擇提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和借鑒思路，但對(duì)于干預(yù)措施的應(yīng)用仍有一段距離，還需要進(jìn)一步的研究與臨床觀察。使用何種干預(yù)措施可以緩解過度運(yùn)動(dòng)造成的心房損傷和纖維化，將是本課題組進(jìn)一步研究的方向。

綜上所述，本研究中發(fā)現(xiàn)，長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后心房發(fā)生纖維化的現(xiàn)象可能與心肌發(fā)生反復(fù)損傷修復(fù)且長期累積有關(guān)，而長期中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)未有纖維化的發(fā)生。研究中發(fā)現(xiàn)，心房組織中TGF-β1和miR-21的長期持續(xù)高表達(dá)可能參與調(diào)控了心房損傷后纖維化的發(fā)生，可能是運(yùn)動(dòng)性心房纖顫發(fā)生的重要機(jī)制之一。

4 結(jié)論

1.長期大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠心肌損傷長期存在，并伴隨大鼠心房膠原蛋白的持續(xù)增加，誘發(fā)了心房纖維化，構(gòu)成了運(yùn)動(dòng)性心房纖顫的病理基礎(chǔ)。

2.長期大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)通過上調(diào)大鼠心房TGF-β1/miR-21信號(hào)通路，介導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)性心房纖維化的發(fā)生過程。

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Effects of Endurance Exercise of Different Intensity on TGF-β1/miR-21 Signaling Pathpay

WANG Shi-qiang1,2,CHANG Yun1,MA Xiao-wen1,RAO Zhi-jian1,2

Objective:To explore effects of different sustained intensive exercise on rat atrial hydroxyproline,and role of TGF-β1/miR-21 signaling pathway through establishing long-term exercise animal model,and provide experimental evidence for clarifiying the mechanism of exercise-induced atrial fibrillation.Methods:72 SD rats were divided into control group (C),moderate intensity group (M) and high instensity group (H) with 24 animals in each group.M and H group were conditioned to run for 4,8,and 16 weeks,5 days/weeks,1h/day.Rats were euthanized to obtain hearts within 24h after exercise.Right atrial were collected.cTnI was quantified by Elisa,hydroxyproline was measured by lkali hydrolysis methodwhich.TGF-β1 and miR-21 gene expression were evaluted by real-time PCR.TGF-β1 protein was quantified by Western Blot.Results:Compared with control and M group,rats serum cTnI increased at 8 weeks/12 weeks/16 weeks (P<0.01).While there was no significance between M group and C gourp.There was no significant difference in hydroxyproline at 8 weeks.Compared with C and M group,hydroxyproline content of H group showed significant increase at 12 weeks and 16 weeks (P<0.01).No difference was oberserved between C group and M group.Hydroxyproline content of H group confirmed a gradual increase with training time,with significant increase from 8 weeks to 16weeks (P<0.05).TGF-β1 gene and protein expression of H group increased compared their control group at 8/12/16 weeks.But no difference was observed between C and M group.TGF-β1 expression had a gradual decrease from 8 to 16 weeks.Compared with their control group,miR-21 expressio of H group showed a significant increase (P<0.05).miR-21 of H group confirmed a gradual decrease with training time,with significant decrease from 8 weeks to 16weeks (P<0.05).No significant difference was observed beteen C and M group.Conclusion:Long-term intensive exercise induced sustained myocardial damage,resulted in sustained collagen increase which induced myocardial fibrosis.This may be a substrate for exercise-induced atrial fibrillation.TGF-β1/miR-21 signaling pathway,upregulated by long-term intensive exercise,may involve in the pathology of intense exercise-induced myocardial damage and atrial fibrillation.

exercise;rat;artrialfibrosis;hydroxyproline;TGF-β1;microRNA-21

2015-07-25；

2015-10-25

國家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)(15-16)。

王世強(qiáng)(1987-)，男，山東濟(jì)寧人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心臟生理和病理，E-mail：suswsq@163.com；常蕓(1957-)，女，內(nèi)蒙古人，研究員，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)員心臟病生理與醫(yī)務(wù)監(jiān)督，Tel：(010)87182526，E-mai：changyun@ciss.cn；馬曉雯(1989-)，女，北京人，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心臟生理和病理；饒志堅(jiān)(1989-)，男，江西上饒人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心臟生理和病理。

1.國家體育總局體育科學(xué)研究所，北京，100061；2.上海體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海 200438 1.China Institute of Sports Science，Beijing 100061，China；2.Shanghai University of Sport，Shanghai 200438,China.

1000-677X(2015)11-0030-08

10.16469/j.css.201511005

G804.5

A