劉軍明，敖杰男

1.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 佛山 528200；2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632

◆實(shí)驗(yàn)研究論著◆

心脈通顆粒含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

劉軍明1，2，敖杰男2

1.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 佛山 528200；2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632

目的：觀察中藥心脈通顆粒含藥血清對(duì)原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H2O2損傷的抗氧化作用。方法：原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞分為3組，正常對(duì)照組用正常大鼠血清培養(yǎng)，模型組用正常大鼠血清培養(yǎng)后，H2O2造損傷模型。心脈通組用心脈通含藥血清干預(yù)12 h后，再加H2O2造損傷。各組分別在H2O2作用6h后檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)：心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性的改變；細(xì)胞免疫組織化學(xué)法檢測(cè)蛋白激酶B（PKB/Akt）的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)蛋白激酶B（PKB/Akt）和內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶（eNOS）的基因表達(dá)變化。結(jié)果：各組心肌細(xì)胞在H2O2作用下活力下降，與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明H2O2損傷模型建立成功；心脈通組細(xì)胞活力高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在正常狀態(tài)下PKB的轉(zhuǎn)錄水平較低，模型組有所升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且心脈通組的轉(zhuǎn)錄水平更高，與正常對(duì)照組和模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常情況下eNOS有表達(dá)，且表達(dá)水平是最高的。模型組中表達(dá)降低，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。心脈通組轉(zhuǎn)錄水平較模型組水平增高（P＜0.05）。結(jié)論：中藥復(fù)方心脈通顆粒能夠增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化損傷能力，保持細(xì)胞的形態(tài)和功能，抑制細(xì)胞調(diào)亡，其機(jī)制可能是通過(guò)PKB/AKT-eNOS信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

心肌缺血；心肌細(xì)胞；心脈通顆粒；蛋白激酶B（PKB/Akt）；內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶（eNOS）

缺血性心臟病以及血管再通后的再灌注損傷，都可以導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡甚至死亡，嚴(yán)重影響心臟功能和病人的預(yù)后。心脈通中藥復(fù)方為臨床驗(yàn)證行之有效的方劑，但是其作用機(jī)理還不清楚，現(xiàn)通過(guò)用H2O2對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行損傷來(lái)模擬心肌缺血的狀態(tài)，初步探討中藥復(fù)方心脈通顆粒對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胰酶(Amresco)，PBS緩沖液，胎牛血清(杭州四季清公司)；冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)FORMA公司)；正立電動(dòng)熒光顯微鏡DMRA2(德國(guó)徠卡儀器有限公司)；RNA提取試劑(天根生化科技有限公司)；梯度PCR儀PC-808(日本AXTEC公司)；TakaRa RNA PCR Kit Ver3.0(大連寶生物工程有限公司)；微型電泳儀、BIO-RAD凝膠成象及分析系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清的獲取 SD大鼠，200～250 g，共50只(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄各半隨機(jī)分成2組，每組25只；分生理鹽水灌胃組和中藥復(fù)方心脈通灌胃組；給藥劑量=臨床常用量(每天3次，每次2料)×動(dòng)物等效劑量系數(shù)(0.018) (按體表面積算)×培養(yǎng)基內(nèi)稀釋度(5倍)；每天給藥2次，早晚各一次，連續(xù)2周；于末次給藥后1～2 h腹主動(dòng)脈取血，每只鼠大概取5 mL血液，1500 r/min(半徑5 cm)離心取上層血清，60℃滅活30 min，-20℃保存。

1.2.2 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定 取剛出生1～3天SD大鼠的乳鼠5只(購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。超凈臺(tái)下，酒精全身消毒，剪開(kāi)胸腔迅速取出心臟置于預(yù)冷的PBS中，洗去血液。均勻剪碎至1 mm3小組織塊，采用逐次胰酶消化法獲取大量單個(gè)心肌細(xì)胞懸液，培養(yǎng)基終止消化，1000 r/min(半徑5 cm)離心后將細(xì)胞與5 mL培養(yǎng)基混合成細(xì)胞懸液，差速貼壁1 h后，接種于6孔板中，24 h換新鮮培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)時(shí)間為3～5天(本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)證實(shí)這時(shí)心肌細(xì)胞活力最好)。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定心肌細(xì)胞的純度。

1.2.3 H2O2損傷模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 接上述方法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，分為正常對(duì)照組(DMEM+細(xì)胞+無(wú)藥大鼠血清)、模型組(DMEM+細(xì)胞+無(wú)藥大鼠血清＋H2O2)、心脈通組(DMEM+細(xì)胞+含藥大鼠血清＋H2O2)。第2天各組加入15%血清，其它組不加，12 h后，在相應(yīng)組加H2O2，使終濃度達(dá)到400 μmol/L[1]，H2O2損傷6～8 h后，常規(guī)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，取細(xì)胞做指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 心肌細(xì)胞活力檢測(cè) 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)3天(生長(zhǎng)接近80%融合)時(shí)，取96孔板分為空白對(duì)照組(DMEM＋無(wú)細(xì)胞，比色時(shí)以此組調(diào)零，設(shè)12孔)、正常對(duì)照組、模型組、心脈通組；每組設(shè)6復(fù)孔。最后D-Hanks液沖洗，更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT液(20 μL/孔)，繼續(xù)孵育4h后，棄去上清液，加入DMSO液(150 μL/孔)，室溫下，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值(λ=570 nm)。

1.4 心肌細(xì)胞不同組蛋白激酶B（PKB/Akt）表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 取造模成功的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，加一抗4℃過(guò)夜，30%的H2O2滅活內(nèi)源性酶，滴加相應(yīng)二抗。加入SABC復(fù)合物，DAB顯色后，酒精梯度脫水，中性樹(shù)膠封片。鏡下觀察，拍照并進(jìn)行圖象分析。

1.5 心肌細(xì)胞總RNA的提取及相應(yīng)指標(biāo)的RT-PCR 按說(shuō)明書(shū)所給步驟，提取RNA，并對(duì)所提RNA進(jìn)行純度鑒定(OD260/OD280在1.8～2.0之間并進(jìn)行RNA電泳)。按試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。第二步將逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，在NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)中查詢出Akt-1(gi：15100163)和內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶(eNOS)(gi：46409655)的mRNA全序，用引物設(shè)計(jì)軟件PRIMER-5設(shè)計(jì)引物，并在NCBI中BLAST，比對(duì)同源性，確保唯一性。Akt-1的上游為5'AGGCATCCCTTCCTTACAG-3'，下游為5’-ACAGCCCGAAGTCCGTTA-3’；目的基因大小為271bp。eNOS上游為5’-CACGAGGACATTTTCGGACT-3’，下游為5’-ACCTAATGAAGCGACGCAGT-3’，目的基因大小為201 bp。同時(shí)設(shè)計(jì)內(nèi)參的引物序列上游為 5’-AGCTATT CTAGCCTTAGACTGAT-3’，下游為5’-CTAGCTTAGGTCA TTAGCTACTAG-3’，目的基因產(chǎn)物大小為385 bp。擴(kuò)增條件同上。依說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行DNA擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，拍照并用BIORAD對(duì)凝膠圖象進(jìn)行灰度測(cè)定，用目的基因的灰度和內(nèi)參的灰度比來(lái)表示轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0采用不同樣本均數(shù)的方差分析，數(shù)據(jù)以(±s)表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)鑒定 見(jiàn)圖1。陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色細(xì)密顆粒，位于胞漿。心肌細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，而非心肌細(xì)胞無(wú)陽(yáng)性表達(dá)顆粒。結(jié)果顯示心肌細(xì)胞分離、純化效果良好，基本無(wú)其它細(xì)胞污染。

圖1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)免疫化學(xué)圖 (400×)

2.2 各組形態(tài)學(xué)改變 見(jiàn)圖2。常規(guī)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。正常對(duì)照組培養(yǎng)24 h形成同心圓放射狀細(xì)胞簇，簇間借偽足相互連接形成功能合胞體搏動(dòng)，每分鐘60～150次，細(xì)胞可長(zhǎng)成單層，長(zhǎng)梭形或多角形，胞漿致密，核小，常為1個(gè)，偶可見(jiàn)雙核，核周胞漿見(jiàn)粗顆粒，至72 h搏動(dòng)頻率、節(jié)律、強(qiáng)度趨于同步，細(xì)胞透光度好，搏動(dòng)規(guī)則、有力，細(xì)胞邊界由于長(zhǎng)成一片而欠清楚。H2O2作用6 h后，可見(jiàn)心肌細(xì)胞發(fā)生顯著的形態(tài)學(xué)改變，多數(shù)細(xì)胞回縮變圓，胞漿濃縮、胞膜起泡，胞體變小，細(xì)胞間橋結(jié)構(gòu)減少，胞間隙明顯增加。細(xì)胞邊界清楚，透光度下降，搏動(dòng)變慢且無(wú)力。也可見(jiàn)部分心肌細(xì)胞脫離、懸浮，溶解壞死。H2O2作用10 h后，細(xì)胞損傷更嚴(yán)重，多數(shù)細(xì)胞變小，固縮，死亡。鏡下觀察細(xì)胞間聯(lián)系消失，細(xì)胞變?yōu)椴煌腹獾暮谏c(diǎn)狀物。心脈通組可見(jiàn)少量的心肌細(xì)胞偽足回縮，細(xì)胞脫落懸浮現(xiàn)象，但損傷程度較輕。

圖2 各組形態(tài)學(xué)改變 (400×)

2.3 各組心肌細(xì)胞活力比較 見(jiàn)表1。各組心肌細(xì)胞在H2O2作用下活力下降，與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明H2O2損傷模型建立成功；心脈通組細(xì)胞活力高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組心肌細(xì)胞活力比較(±s)

表1 各組心肌細(xì)胞活力比較(±s)

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組心脈通組樣本數(shù)666心肌細(xì)胞活力0.409±0.090 0.223±0.054①0.298±0.041①②

2.4 各組PKB表達(dá)比較 見(jiàn)圖3、表2。正常對(duì)照組中只有少數(shù)細(xì)胞胞漿中有棕黃色表達(dá)。而模型組棕黃色顆粒較正常對(duì)照組增多，心脈通組較模型組顯著增多。

圖3 各組PKB表達(dá)變化 (400×)

表2 各組PKB表達(dá)比較(±s)

表2 各組PKB表達(dá)比較(±s)

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組心脈通組樣本數(shù)666 PK B表達(dá)83.28±0.573 106.88±2.741①167.98±5.749①②

2.5 各組PKB和eNOS轉(zhuǎn)錄水平變化比較 見(jiàn)圖4、圖5、表3。在正常狀態(tài)下PKB的轉(zhuǎn)錄水平較低，模型組有所升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且心脈通組的轉(zhuǎn)錄水平更高，與正常對(duì)照組和模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。正常情況下eNOS有表達(dá)，且表達(dá)水平是最高的。模型組中表達(dá)降低，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。心脈通組轉(zhuǎn)錄水平較模型組水平增高(P＜0.05)。

3 討論

氧自由基在缺血心肌凋亡過(guò)程中起重要作用，本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了氧化應(yīng)激和缺血性心臟病有密切關(guān)系。PKB (protein kinase B)又稱Akt，處于多條信號(hào)通路的重要交叉點(diǎn)，PKB的磷酸化在缺血所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷方面有重要作用，如雌激素對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用部分是通過(guò)磷酸化PKB而起到的[2]。PKB的作用底物有很多，其中eNOS可催化L-精氨酸與分子氧反應(yīng)而產(chǎn)生NO。NO有調(diào)節(jié)血管張力，抑制白細(xì)胞黏附，抑制血小板聚集，抑制平滑肌細(xì)胞分裂增殖等生理功能[3]。eNOS和NO系統(tǒng)對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，刺激新生血管生成，及抑制TGF-β1/ Smad-2信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的[4]。

圖4各組PKB電泳圖

圖5 eNOS電泳圖

表3 各組PKB和eNOS轉(zhuǎn)錄水平變化比較(±s)

表3 各組PKB和eNOS轉(zhuǎn)錄水平變化比較(±s)

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組心脈通組樣本數(shù)666 PK B 0.40±0.022 0.60±0.026①0.88±0.027①②eN O S 1.01±0.052 0.63±0.032①0.92±0.154①②

H2O2可啟動(dòng)PKB通路，PKB的直接下游底物eNOS必定出現(xiàn)相應(yīng)變化，心脈通含藥血清可以提高PKB和eNOS在氧化損傷細(xì)胞中的表達(dá)；進(jìn)而增加NO的產(chǎn)生，PKB的活化和eNOS的增加可以抑制心肌細(xì)胞的調(diào)亡，對(duì)氧化損傷狀態(tài)下的心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，推測(cè)中藥復(fù)方心脈通顆粒的作用是通過(guò)PKB/AKT-eNOS-NO途徑，這也可能是其主要途徑。

中醫(yī)學(xué)所認(rèn)識(shí)的胸痹心痛包括急慢性缺血性心臟病。胸痹心痛又多與血瘀有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以氣血理論為基礎(chǔ)，H2O2損傷很好模擬了缺血性心肌病，外界環(huán)境(H2O2)的損傷產(chǎn)生了細(xì)胞功能的損害，即產(chǎn)生了陽(yáng)的不足，細(xì)胞跳動(dòng)頻率的下降也說(shuō)明了陽(yáng)或氣的虛損，也即《傷寒論》所謂“陽(yáng)微”。心脈通顆粒以人參、黃芪、丹參為主，組方以氣藥配以活血化瘀藥，可以改善心臟的缺氧狀態(tài)，減輕缺血對(duì)心臟的損傷。單味中藥抗氧化作用研究很多，復(fù)方藥較少。心脈通顆粒中藥復(fù)方主要組成成分是總黃酮類物質(zhì)，這為黃酮類成分的中藥在對(duì)抗氧化損傷方面提供了一定證據(jù)，也為以后臨床組方治療心血管系統(tǒng)疾病方面提供了一定依據(jù)。但其詳細(xì)完整的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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[4]Lei-Lei Chen， Hang Yin，Jun Huang．Inhibition of TGF-β1 signaling by eNOS gene transfer improves ventricular remodeling after myocardialinfarction through angiogenesis and reduction of apoptosis[J]．Cardiovascular Pathology，2007，16(4)：221-230．

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

R542.2

A

0256-7415（2015）05-0267-04

10.13457/j.cnki.jncm.2015.05.127

2014-11-10

教育部留學(xué)回國(guó)人員基金資助項(xiàng)目（2003-406）

劉軍明（1980-），男，主治中醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治心血管疾病。

敖杰男，E-mail：taojn@jnu.edu.cn。