王雪梅，尚德浩

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所牙體牙髓病學(xué)研究室；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院種植中心，沈陽(yáng) 110002）

姜黃素對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響

王雪梅1，尚德浩2

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所牙體牙髓病學(xué)研究室；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院種植中心，沈陽(yáng) 110002）

目的研究姜黃素對(duì)腫瘤壞死因子α（TNF-α）處理成骨細(xì)胞引起凋亡的影響。方法將原代培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞分為3組：對(duì)照組（不做處理）、TNF-α處理組（10 ng/mL TNF-α處理24 h）、姜黃素預(yù)處理組（10 μmol/L姜黃素預(yù)處理2 h，10 ng/mL TNF-α處理24 h），通過(guò)Western blot方法檢測(cè)Fas、TRAIL、caspase-2、caspase-3、caspase-8及Bcl-2的蛋白水平，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)成骨細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果與對(duì)照組相比，12和24 h時(shí)TNF-α處理組caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL的蛋白水平均升高（P＜0.01），Bcl-2的蛋白水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；12和24 h時(shí)姜黃素預(yù)處理組caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL的蛋白水平均較TNF-α處理組明顯降低（P＜0.01）。20倍熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)，對(duì)照組凋亡的成骨細(xì)胞數(shù)目非常少，TNF-α處理組凋亡的成骨細(xì)胞數(shù)目明顯增多，姜黃素預(yù)處理組凋亡的成骨細(xì)胞數(shù)目明顯減少。結(jié)論姜黃素可以抑制TNF-α引起的成骨細(xì)胞凋亡。

腫瘤壞死因子α；成骨細(xì)胞；凋亡

與其他組織細(xì)胞相同，骨組織中的細(xì)胞凋亡是骨代謝的一種形式，成骨細(xì)胞參與了骨改建的過(guò)程。由于成骨細(xì)胞凋亡可減少成骨細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)而可以引發(fā)骨重建［1，2］。姜黃素是從一些植物根莖中提取的化學(xué)成分，可作為食品著色劑，具有抗炎、抗腫瘤、降血脂、抗氧化等作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)不同種類(lèi)細(xì)胞所起的凋亡作用不同，對(duì)許多腫瘤細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡的作用［3～6］，而對(duì)白細(xì)胞介素1引起的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡具有抑制作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）通過(guò)腫瘤壞死因子受體1、腫瘤壞死因子受體2和死亡受體如Fas的相互作用，激活半胱氨酸蛋白酶（caspase）誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡［8，9］。本研究通過(guò)在成骨細(xì)胞中加入TNF-α，模擬根尖周炎或牙周炎時(shí)骨質(zhì)所處的微環(huán)境，建立骨細(xì)胞的凋亡模型，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)加入姜黃素后凋亡相關(guān)蛋白水平的變化，探討姜黃素對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響，為牙周炎及根尖周炎的臨床藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生24 h內(nèi)的SD胎鼠，雌雄不限，體質(zhì)量約6 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1.2 主要材料與試劑

兔抗鼠Bcl-2抗體，兔抗鼠活性caspase-2、caspase-3、caspase-8抗體，兔抗鼠Fas抗體，兔抗鼠TRAIL抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；姜黃素，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TNF-α，購(gòu)自華美公司。

1.3 原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞

進(jìn)行成骨細(xì)胞培養(yǎng)，以1∶2進(jìn)行傳代，每隔2 d換液1次，5～7 d進(jìn)行傳代［10］。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

取第3～4代的成骨細(xì)胞以5×106/mL密度接種于6孔板，分為3組：對(duì)照組（不做處理）；TNF-α處理組（10 ng/mL TNF-α處理24 h）；姜黃素預(yù)處理組（10 μmol/L姜黃素預(yù)處理2 h，10 ng/mL TNF-α處理24 h）。分別在TNF-α處理成骨細(xì)胞12 h和24 h時(shí)收集細(xì)胞，細(xì)胞中加入蛋白裂解緩沖液，20 min后轉(zhuǎn)移至EP管。每孔進(jìn)行加樣，轉(zhuǎn)膜后在室溫下將兔抗鼠Bcl-2抗體、兔抗鼠caspase-2、caspase-3、caspase-8抗體、兔抗鼠Fas抗體、兔抗鼠TRAIL抗體、稀釋于封閉液中，與膜孵育4℃過(guò)夜。在室溫下將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋于封閉液中，與膜孵育60 min，加入顯色液避光至條帶出現(xiàn)。

1.5 應(yīng)用TUNEL法原位觀察成骨細(xì)胞凋亡

將無(wú)菌的蓋玻片置于6孔板中，每孔1片。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以0.05%胰酶消化后，稀釋成5×107/L，取0.5 mL滴于蓋玻片上，37℃孵育2 h后，每孔加2 mL培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定細(xì)胞60 min，加配制好的生物素標(biāo)記液，37℃孵育60 min，在樣品上加50 μL過(guò)氧化物酶－鏈親和素復(fù)合物工作液，室溫孵育30 min，加入FITC標(biāo)記的二抗，封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Fas、TRAIL、caspase-2、caspase-3、caspase-8及Bcl-2的蛋白水平

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組成骨細(xì)胞基礎(chǔ)表達(dá)Fas、TRAIL、caspase-2、caspase-3、caspase-8以及Bcl-2，TNF-α處理組在12和24 h時(shí)caspase-2、caspase-3、caspase-8c、Fas、TRAIL的蛋白水平均較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），Bcl-2的蛋白水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）。姜黃素預(yù)處理組在12和24 h時(shí)caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL的蛋白水平都較TNF-α處理組明顯降低（P＜0.01或0.05），Bcl-2的蛋白水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 Western blot檢測(cè)caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL和Bcl-2蛋白的表達(dá)Fig.1 Western blot analysis for caspase-2，caspase-3，caspase-8，F(xiàn)as，TRAIL，and Bcl-2

表1 Western blot檢測(cè)caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL和Bcl-2的表達(dá)水平Tab.1 Expressions of caspase-2，caspase-3，caspase-8，F(xiàn)as，TRAIL，and Bcl-2 detected by Western blot

2.2 TUNEL法觀察凋亡的成骨細(xì)胞

凋亡的成骨細(xì)胞標(biāo)志為核染色質(zhì)濃縮或形成各種形狀的碎塊。20倍熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)：在無(wú)任何刺激存在的對(duì)照組凋亡的成骨細(xì)胞數(shù)目非常少（圖2A），TNF-α處理組凋亡的成骨細(xì)胞數(shù)目明顯增多（圖2B），姜黃素預(yù)處理組凋亡的成骨細(xì)胞數(shù)目較TNF-α處理組明顯減少（圖2C）。

圖2 TUNEL法觀察凋亡的成骨細(xì)胞 ×20Fig.2 Apoptosis of osteoblasts detected by TUNEL×20

3 討論

成骨細(xì)胞是參與根尖周骨質(zhì)改建的主要細(xì)胞之一，成骨細(xì)胞最終有3種轉(zhuǎn)歸：一部分被埋于其自身分泌的骨基質(zhì)中轉(zhuǎn)換為骨細(xì)胞；一部分轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止的骨襯細(xì)胞；其余的則以凋亡的形式死亡［11，12］，成骨細(xì)胞的凋亡在骨重建中發(fā)揮重要作用［13，14］。研究證明，TNF-α可以引起成骨細(xì)胞凋亡［15～17］。本研究通過(guò)在成骨細(xì)胞中加入TNF-α，模擬根尖周炎或牙周炎時(shí)骨質(zhì)所處的微環(huán)境，建立骨細(xì)胞凋亡模型。TNF-α引起成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制包括：（1）TNF-α受體死亡結(jié)構(gòu)域需要通過(guò)Fas相關(guān)受體死亡結(jié)構(gòu)域來(lái)激活caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)；（2）TNF-α增強(qiáng)Fas配體或放線菌酮引起的凋亡刺激。Fas通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抗體或者其成熟配體可以導(dǎo)致受體低聚反應(yīng)，以及銜接蛋白和caspase-8前體的募集反應(yīng)，進(jìn)而形成誘導(dǎo)死亡的信號(hào)復(fù)合物，然后caspase-8前體被蛋白水解激活并分解為多種底物，包括caspase-3前體，從而完成凋亡過(guò)程。

由于TNF-α引起的成骨細(xì)胞凋亡與Fas、caspase-2、caspase-3、caspase-8等有關(guān)，所以本研究通過(guò)Western blot方法檢測(cè)加入10 ng/mL TNF-α培養(yǎng)24 h時(shí)caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL的蛋白水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白水平均升高，Bcl-2作為抑制凋亡的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。姜黃素預(yù)處理組caspase-2、caspase-3、caspase-8和Fas、TRAIL的蛋白水平均較TNF-α處理組明顯降低，此結(jié)果提示caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL凋亡相關(guān)蛋白參與了TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡，而姜黃素可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。Bcl-2與TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)，caspases-2和caspase-8由于含有較長(zhǎng)的氨基端前結(jié)構(gòu)域，作為啟動(dòng)子發(fā)揮作用，而caspases-3由于含有較短的氨基端前結(jié)構(gòu)域，作為執(zhí)行子發(fā)揮作用，普遍認(rèn)為caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。因此TNF-α通過(guò)激活Fas、TRAIL、caspase-2、caspase-8進(jìn)而啟動(dòng)caspase-3降解caspase的底物分子，發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡。姜黃素通過(guò)抑制這些凋亡活化蛋白進(jìn)而抑制了成骨細(xì)胞的凋亡。TUNNL結(jié)果顯示，TNF-α處理成骨細(xì)胞24 h時(shí)凋亡的成骨細(xì)胞數(shù)目明顯增多，而姜黃素預(yù)處理組凋亡的成骨細(xì)胞數(shù)目與TNF-α處理組相比明顯減少（P＜0.01），與Western blot結(jié)果一致。

正常的根尖周組織和牙周組織處于一種平衡狀態(tài)，這種平衡狀態(tài)受機(jī)體內(nèi)環(huán)境包括細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)制約。當(dāng)細(xì)菌感染時(shí)，牙周袋或根管內(nèi)細(xì)菌的毒素及其代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，打破平衡，出現(xiàn)骨喪失。到目前為止，沒(méi)有抑制牙周炎和根尖周炎引起骨喪失的理想藥物。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過(guò)抑制TNF-α引起的成骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增加成骨細(xì)胞的數(shù)目，減少骨破壞的發(fā)生，為根尖周炎及牙周炎引起骨破壞的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（編輯 陳 姜）

Effect of Curcumin on Tumor Necrosis Factor α-induced Osteoblast Apoptosis

WANG Xue-mei1，SHANG De-hao2

（1.Departments of Endodentics，Experimental Center，School of Stomatology，China Medical University，Institution of Oral Medicine，Shenyang 110002，China；2.Departments of Implant，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo study the effect of curcumin on tumor necrosis factor α（TNF-α）-induced osteoblast apoptosis.MethodsPrimary osteoblast cells were divided into three groups：control group（no treated），group treated with TNF-α（treated with TNF-α for24 h），and group pretreated with curcumin（treated with curcumin for 2 h，and then treated with TNF-α for 24 h）.Western blot analysis was carried out with primary antibodies against caspase-2，caspase-3，caspase-8，Bcl-2，F(xiàn)as，and TRAIL.Apoptosis cells were observed by immunofluorescence microscope.ResultsIn group treated with TNF-α，the protein levels of caspase-2，caspase-3，caspase-8，F(xiàn)as，and TRAIL increased（P＜0.01），whereas the protein level of Bcl-2 remained unchanged（P＞0.05）.In group pretreated with curcumin，the protein levels of caspase-2，caspase-3，caspase-8，F(xiàn)as，and TRAIL were lower than those in group treated with TNF-α（P＜0.01）.The number of apoptotic cells was dramatically increased after the administration of TNF-α.While the number of apoptotic cells decreased in the presence of curcumin.ConclusionThe present study clearly demonstrated that curcumin can suppress osteoblast apoptosis induced by TNF-α.

tumor necrosis factor α；osteoblast；apoptosis

R781.4

A

0258-4646（2015）12-1094-04

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013225090）

王雪梅（1976-），女，副主任醫(yī)師，博士. E-mail：wangxuemeisdh@hotmail.com

2015-09-13

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