馬賢德，張威，關(guān)洪全

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)1.教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室；2.附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫病原生物教研室，沈陽 110847）

白色念珠菌感染對脾虛模型小鼠T細(xì)胞亞群的影響

馬賢德1，張威2，關(guān)洪全3

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)1.教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室；2.附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫病原生物教研室，沈陽 110847）

目的探討白色念珠菌感染后脾虛小鼠T細(xì)胞亞群的變化及其免疫機(jī)制。方法將健康SPF級昆明種小白鼠150只隨機(jī)分為空白對照組（N1組，n=30）、空白感染白念組（N2組，n=40）、脾虛模型對照組（M1組，n=40）、脾虛感染白念組（M2組，n=40）。N2和M2組小鼠經(jīng)口感染白色念珠菌（2×108CFU/mL，0.2 mL/10 g體質(zhì)量）。分別于染菌第7、14、21天，從各組小鼠中隨機(jī)抽取10只，檢測小鼠腸黏膜固有層中CD4+/CD8+T細(xì)胞百分比、小腸組織中干擾素γ（IFN-γ）和白細(xì)胞介素4（IL-4）mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與N1組比較，N2組、M1組及M2組小鼠小腸黏膜固有層中CD4+T細(xì)胞比例下降（P＜0.01），CD8+T細(xì)胞比例上升（P＜0.01），CD4/CD8比值顯著下降（P＜0.01），IFN-γ、IL-4mRNA及蛋白的表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01）。IFN-γ以M2組上調(diào)最為明顯，而IL-4則以N2組上調(diào)最為明顯。結(jié)論脾虛小鼠對白色念珠菌的易感性增加，感染的發(fā)生機(jī)制可能與機(jī)體自身對Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

脾虛證；白色念珠菌；感染；T細(xì)胞亞群

假絲酵母菌中，白假絲酵母菌（Candida albicans）是最常見的致病菌。白假絲酵母菌又稱白色念珠菌，為條件性致病真菌。脾虛證是指脾氣不足、失其健運(yùn)所表現(xiàn)的一系列癥候［1，2］，其現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病理機(jī)制可歸納為消化系統(tǒng)機(jī)能減退、胃腸道黏膜保護(hù)性屏障作用減退、胃腸道激素水平紊亂、細(xì)胞內(nèi)能量代謝減退、免疫功能低下等。研究表明，機(jī)體處于脾虛的狀態(tài)下，對于白色念珠菌的易感性大大增加。本研究擬從T細(xì)胞亞群及Th1/Th2平衡角度探討白色念珠菌感染脾虛模型小鼠的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SPF級昆明種小鼠150只，購自遼寧長生生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2010-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物室內(nèi)［許可證號：SYXK（遼）2013-0009］。常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由食水，12 h晝夜節(jié)律。

1.1.2 菌株及試劑：白色念珠菌菌株（Candida albicans 03382株），由北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科惠贈。CD4、CD8流式抗體購自Biolegend公司［貨號：CD4（100412），CD8（100706）］。干擾素γ抗體（anti-interferon gamma，anti-IFN-γ）及白細(xì)胞介素4抗體（antiinterleukin-4，anti-IL-4）抗體購自Abcam公司［貨號：anti-IFN-γ（ab24979）；anti-IL-4（ab11524）］；HRP標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備：電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH·B11·500型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-4200SF型）；垂直板電泳裝置（上海天能科技有限公司，VE-180型）；梯度PCR儀（美國ABI公司，VERITI96孔梯度PCR型），水平電泳裝置（上海天能科技有限公司，HE-120型）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：將150只小鼠隨機(jī)分為空白組（N組，n=70）和脾虛模型組（M組，n=80）。對M組小鼠采用飲食不節(jié)加勞倦過度的方法復(fù)制脾虛小鼠模型。模型復(fù)制成功后，再次分別將N組及M組小鼠各隨機(jī)分為2組：空白對照組（N1組，n=30），空白感染白念組（N2組，n=40）；脾虛模型對照組（M1組，n=40），脾虛感染白念組（M2組，n=40）。

1.2.2 脾虛模型復(fù)制：實(shí)驗(yàn)第1天起，參照文獻(xiàn)［3～5］，M組小鼠單日喂飼甘藍(lán)，并強(qiáng)制性游泳至耐力極限；雙日施加豬油脂灌胃（0.2 mL/10 g體質(zhì)量），正常進(jìn)食，連續(xù)14 d，N組小鼠正常飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)14 d后，按照脾虛模型宏觀診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］對M組小鼠進(jìn)行模型評價：造模小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，便溏或稀便，食少納呆，毛色枯槁，蜷縮聚堆、反應(yīng)遲鈍甚至膽怯狀態(tài)等表現(xiàn)，說明脾虛造模成功。

1.2.3 白色念珠菌感染：脾虛模型復(fù)制成功后，對N組和M組小鼠再次進(jìn)行分組，次日對N2組和M2組小鼠經(jīng)口感染白色念珠菌（濃度2×108CFU/mL，劑量0.2 mL/10 g體質(zhì)量），N1、M1組小鼠給予等量生理鹽水經(jīng)口灌胃。

1.2.4 指標(biāo)檢測：分別于染菌第7、14、21天，從各組小鼠中隨機(jī)抽取10只，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠腸黏膜固有層中CD4+/CD8+T細(xì)胞百分比。采用RT-PCR法檢測各組小鼠小腸組織中IFN-γ、IL-4mRNA的表達(dá)水平。引物序列：IFN-γ：上游5′-CACTCGACCTTAATCTA-3′，下游5′-CTCTTGATTCAATGCTTCA-3′，擴(kuò)增片段長度514 bp；IL-4：上游5′-ATGGGTCTCACCTCCCAACT G-3′，下游5′-TCAATGCCTGTAGTATTTCTTC-3′，擴(kuò)增片段長度399 bp；β-actin：5′-AGCGGGAAATCG TGCGTG-3′，5′-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3′，擴(kuò)增片段長度288 bp。擴(kuò)增后行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，測定條帶積分光密度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Western blot法檢測各組小鼠小腸組織中IFN-γ、IL-4蛋白的表達(dá)水平，提取小腸組織中總蛋白，電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)一抗（1∶1 500）、二抗（1∶2 000）4℃孵育過夜后，ECL發(fā)光，凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，測定條帶灰度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果

感染白色念珠菌后第7、14、21天，與N1組比較，N2組、M1組及M2組小鼠小腸黏膜固有層中CD4+T細(xì)胞比例均下降，但染菌后第7天N2菌組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CD8+T細(xì)胞比例均不同程度上升，除染菌第14天外，其余2時間點(diǎn)僅M2組與N1組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；CD4+/CD8+比值不同程度下降，與N1組比較，M1組和M2組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

2.2 各組小鼠小腸組織中IFN-γ、IL-4 mRNA及蛋白的表達(dá)水平

RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：與N1組比較，其他3組小鼠小腸組織中IFN-γmRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與N2組比較，M1組IFN-γ mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），而M2組則顯著升高（P＜0.05）；與M1組比較，M2組IFN-γmRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。見表2，圖1。

表1 實(shí)驗(yàn)第7、14、21天各組小鼠小腸黏膜固有層中T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果Tab.1 Analysis of T cell subsets in the lamina of the natural layer of the small intestine on day 7，14 and 21

表1 實(shí)驗(yàn)第7、14、21天各組小鼠小腸黏膜固有層中T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果Tab.1 Analysis of T cell subsets in the lamina of the natural layer of the small intestine on day 7，14 and 21

1）P＜0.05，2）P＜0.01 vs N1 group；3）P＜0.01 vs N2 group；4）P＜0.05，5）P＜0.01 vs M1 group.

Group CD4+T（%） CD8+T（%） CD4+/CD8+ N1 Day 7 37.23±1.11 23.18±3.32 1.63±0.23 Day 14 38.24±1.31 21.43±3.15 1.82±0.29 Day 21 38.51±1.41 23.58±2.24 1.65±0.15 N2 Day 7 36.56±1.67 24.02±3.40 1.56±0.28 Day 14 32.65±1.402） 27.27±4.192） 1.23±0.222）Day 21 34.96±2.322） 27.10±3.39 1.32±0.252）M1 Day 7 33.96±2.162），3） 25.40±3.55 1.37±0.281）Day 14 32.54±1.442） 27.23±3.642） 1.22±0.212）Day 21 34.98±1.792） 25.63±2.97 1.38±0.212）M2 Day 7 31.10±1.722），3），4） 30.41±2.672），3），4） 1.03±0.122），3），4）Day 14 27.78±0.902），3），4） 31.90±3.302），3），4） 0.88±0.112），3），4）Day 21 30.30±1.622），3），4） 29.87±2.852），4），5） 1.02±0.132），3），4）

圖1 感染不同時間各組小鼠小腸組織中IFN-γmRNA和蛋白的表達(dá)Fig.1 The expression of IFN-γmRNA and protein in the small intestine at day 7，14，21

與N1組比較，其他3組小鼠小腸組織中IL-4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與N2組比較，M1組及M2組IL-4mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與M1組比較，M2組IL-4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。見表2，圖2。

3 討論

中醫(yī)學(xué)脾的范疇不同于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，因此，脾虛并不是解剖學(xué)中脾臟的某種病理改變。根據(jù)中醫(yī)學(xué)關(guān)于脾虛的描述可知，脾虛證指的是消化系統(tǒng)出現(xiàn)的一系列癥候群，主要臨床表現(xiàn)為消化不良、小腸吸收功能減退、機(jī)體免疫力低下等［7，8］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，脾虛證更容易出現(xiàn)在消耗性疾病的中晚期。

白色念珠菌屬于條件性致病菌的一種，正常情況下寄生在人體多個部位，不致病。當(dāng)機(jī)體處于免疫功能紊亂或菌群失調(diào)狀態(tài)時，極易引發(fā)急性、亞急性或慢性感染，是最常見的真菌感染疾病。白色念珠菌易侵犯皮膚、黏膜，也可引發(fā)內(nèi)臟或全身的系統(tǒng)性感染［9］。當(dāng)機(jī)體處于脾虛狀態(tài)時，機(jī)體的免疫功能低下，皮膚黏膜的正常菌群平衡遭到破壞，屬于白色念珠菌感染高發(fā)期。研究表明，脾虛狀態(tài)下發(fā)生白色念珠菌感染，可導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平的改變，同時局部黏膜免疫也受到一定的抑制［10，11］。

本研究結(jié)果顯示：小鼠感染白色念珠菌后，小腸黏膜固有層中CD4+T細(xì)胞百分比顯著下降，而脾虛狀態(tài)小鼠的CD4+T細(xì)胞百分比也比N1組顯著降低，M2組小鼠CD4+T細(xì)胞最少；CD8+T細(xì)胞百分比則與CD4+T相反，與N1組比較，N2組、M1組、M2組呈逐漸增多趨勢，從而導(dǎo)致CD4+T/CD8+T的比例呈逐漸降低的趨勢。提示白色念珠菌感染對正常機(jī)體的免疫功能具有一定的抑制作用，且當(dāng)機(jī)體處于脾虛狀態(tài)時，免疫功能下降更為明顯，這可能是脾虛狀態(tài)對白色念珠菌易感的原因之一。表明脾虛狀態(tài)與白色念珠菌感染可對免疫功能的抑制產(chǎn)生協(xié)同作用。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，感染最嚴(yán)重階段發(fā)生在染菌后的第2周，第3周各項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)好轉(zhuǎn)趨勢，分析其原因可能是一次染菌時機(jī)體具有抗感染能力，該劑量白色念珠菌引發(fā)的感染具有自愈的可能，且染菌后立即停止了脾虛模型復(fù)制的誘導(dǎo)因素，模型在去除誘導(dǎo)因素后具有一定的自愈性。

表2 實(shí)驗(yàn)第7、14、21天各組小鼠小腸組織中IFN-γ、IL-4mRNA及蛋白表達(dá)水平Tab.2 The expression of IFN-γ and IL-4mRNA and protein in the small intestine on day 7，14 and 21

表2 實(shí)驗(yàn)第7、14、21天各組小鼠小腸組織中IFN-γ、IL-4mRNA及蛋白表達(dá)水平Tab.2 The expression of IFN-γ and IL-4mRNA and protein in the small intestine on day 7，14 and 21

1）P＜0.01 vs N1 group；2）P＜0.05，3）P＜0.01 vs N2 group；4）P＜0.05，5）P＜0.01 vs M1 group.

Group IFN-γ IL-4 mRNA Protein mRNA Protein N1 Day 7 0.231±0.022 0.235±0.018 0.254±0.027 0.274±0.029 Day 14 0.241±0.020 0.234±0.021 0.246±0.013 0.267±0.024 Day 21 0.224±0.021 0.221±0.011 0.261±0.029 0.258±0.025 N2 Day 7 0.438±0.0511） 0.425±0.0481） 0.623±0.0691） 0.629±0.0661）Day 14 0.400±0.0411） 0.414±0.0451） 0.663±0.0571） 0.685±0.0461）Day 21 0.383±0.0261） 0.390±0.0361） 0.729±0.0711） 0.709±0.0761）M1 Day 7 0.365±0.0311），3） 0.375±0.0371），2） 0.390±0.0331），3） 0.398±0.0351），3）Day 14 0.349±0.0391），3） 0.354±0.0301），3） 0.419±0.0361），3） 0.432±0.0391），3）Day 21 0.340±0.0221），3） 0.337±0.0261），3） 0.439±0.0271），3） 0.437±0.0391），3）M2 Day 7 0.562±0.0541），3），4） 0.520±0.0561），3），5） 0.442±0.0461），3），4） 0.453±0.0291），3），4）Day 14 0.501±0.0491），3），4） 0.508±0.0611），3），5） 0.470±0.0471），3），5） 0.477±0.0461），3），4）Day 21 0.481±0.0531），3），4） 0.475±0.0511），3），4） 0.521±0.0551），3），5） 0.506±0.0421），3），5）

圖2 感染不同時間各組小鼠小腸組織中IL-4mRNA和蛋白的表達(dá)Fig.2 The expression of IL-4mRNA and protein in the small intestine at day 7，14，21

根據(jù)所分泌細(xì)胞因子的種類和功能，CD4+T細(xì)胞分為Th1和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子為IFN-γ、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factor β，TNF-β）等；Th2細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子為IL-4、IL-10等。研究表明，IFN-γ具有促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1，同時抑制Th2細(xì)胞的增殖的作用，而IL-4具有誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化的作用，二者相互抑制并獲得平衡。病理情況下，Th1/Th2細(xì)胞的平衡發(fā)生偏移，引起Th1/Th2細(xì)胞所分泌細(xì)胞因子的量發(fā)生改變，從而引發(fā)疾病。

本研究結(jié)果顯示：與N1組比較，N2組、M1組、M2組小鼠小腸組織中IFN-γ、IL-4 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均上調(diào)，IFN-γ以M2組上調(diào)最為明顯，而IL-4則以N2組上調(diào)最為明顯。提示白色念珠菌感染后機(jī)體的免疫功能狀態(tài)決定了感染的發(fā)生、發(fā)展，當(dāng)機(jī)體免疫功能正常時，染菌后以Th2細(xì)胞輔助的體液免疫應(yīng)答為主導(dǎo)，而當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時，染菌后則以Th1細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫為主導(dǎo)。

綜上所述，脾虛小鼠對白色念珠菌的易感性增加，感染的發(fā)生機(jī)制可能與機(jī)體自身對Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

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（編輯 王又冬）

Influence of Candida albicans Infection on T Cell Subsets in the Mice with Spleen Deficiency

MAXian-de1，ZHANG Wei2，GUAN Hong-quan3

（1.Biology Technology Lab，Teaching Experiment Center，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.Department of Internal Medicine-neurology，Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；3.Department of Immunology and Pathogenic Biology，Basic Medical College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China）

ObjectiveTo observe the influence of Candida albicans infection on T cell subsets in mice with spleen deficiency，so as to explore the immune mechanism.MethodsTotally 150 healthy SPF mice were randomly divided into four groups：control group（N1 group，n=30）；Candida albicans infection group（N2，n=40），spleen deficiency model group（M1，n=40），spleen deficiency model combined with Candida albicans infection group（M2，n=40）.N2 and M1 mice were infected by Candida albicans at a concentration of 2×108CFU/mL.Ten mice were randomly selected from each group at 7，14，and 21 days after infection respectively，and the index was detected.Flow cytometry was used to detect the percentage of CD4+/CD8+T cells in intestinal mucosa of mice，and the expression level of IL-4and IFN-γmRNA was detected by RT-PCR assay.The levels of IFN-γ and IL-4 were detected by Western blot assay.ResultsCompared with N1 group，the proportion of CD4+T cells in the lamina of the natural layer of the small intestine was decreased（P＜0.01），the proportion of CD8+T cells was increased（P＜0.01），the ratio of the two was significantly decreased（P＜0.01），and the expression levels of IL-4，mRNA I FN-γ and protein in the small intestine tissues were increased in other groups（P＜0.01）.In addition，the expression level of IFN-γ was significantly increased in M2 group，while the expression of IL-4 was significantly increased in N2 group.ConclusionThe susceptibility of Candida albicans infection was increased in spleen deficiency mice，which may be closely related to the regulation of Th1/Th2 balance.

spleen deficiency；Candida albicans；infection；T lymphocyte subsets

R392.9

A

0258-4646（2015）12-1070-05

國家自然科學(xué)基金（81173145）

馬賢德（1979-），男，實(shí)驗(yàn)師，博士研究生.

關(guān)洪全，E-mail：hongquanguan@sina.com

2015-10-27

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