范瑞娟等

【摘要】目的：在Zea Longa線栓法的基礎上，對現(xiàn)有的改良線栓法進一步改進，為建立更加穩(wěn)定的局灶性腦缺血再灌注模型提供參考。方法：30只雄性SD大鼠隨機分Zea Longa線栓法組、改良線栓法組、新式線栓法組三組，每組10只。比較上述3組大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的制作時間，及再灌注24h后大鼠的神經(jīng)功能評分、腦梗死體積率及動物死亡率等指標，評價經(jīng)過再改進后的新式線栓法制作的大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的有效性。結果：Zea Longa線栓法組、改良線栓法組、新式線栓法組大鼠的神經(jīng)功能評分、腦梗死體積率，模型成功率無明顯差異（P>001），但新式線栓法組的模型制作時間及大鼠死亡率明顯低于Zea Longa線栓法組和改良線栓法組。結論：經(jīng)過進一步改進的新式線栓法可以有效縮短模型制作時間，減少動物死亡率，優(yōu)于Zea Longa線栓法組、改良線栓法組，使大腦中動脈阻塞再灌注模型的建立更加簡易穩(wěn)定。

【關鍵詞】線栓法；局灶性腦缺血再灌注；模型研究

【中圖分類號】R-332【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2014）02-0026-02

缺血性腦血管疾病已成為現(xiàn)代社會致死、致殘的最主要疾病之一，而抑制再灌注損傷是缺血性腦血管疾病治療的重要環(huán)節(jié)，開展對腦缺血再灌注損傷模型、損傷機制、防治的研究具有重要意義。其中，最為首要的是建立有效的腦缺血再灌注模型。而大腦中動脈（MCA）為臨床上缺血性腦損傷的易患部位，故大腦中動脈阻斷（MCAO）模型被廣泛用于腦梗塞的研究[1]。

制備MCAO模型的方法有很多種，迄今主要包括光化學法，三氯化鐵法，線栓法，自體血栓法，電流損傷法，自發(fā)性MCAO等[2]。其中線栓法制備的大鼠局灶性腦缺血模型是目前公認的較為理想的局灶性腦缺血模型.它具有不開顱，損傷小，重復性好的優(yōu)點，并可準確控制缺血和再灌注的時間，因此應用范圍廣泛[3]。但是我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，Longa線栓法模型因為要分離結扎翼腭動脈，游離頸外動脈，損傷大，動物死亡率高，模型成功率低。而現(xiàn)階段的改良模型因為要游離結扎頸外動脈，手術損傷仍然較大，操作時間偏長，動物死亡率仍然較高。因此我們對模型進行了進一步的改進，使手術更簡潔，操作時間更短，動物死亡率更低，模型更具穩(wěn)定性。

1材料與方法

11實驗動物及分組30只SPF級雄性SD大鼠，體重250～300g，隨機分為Longa線栓法組、改良線栓法組、新式線栓法組，每組10只。由長沙市天勤生物技術有限公司提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（湘）2009-0012。

12試劑及線栓準備TTC染色劑由貴州博奧瑞杰生物科技有限公司提供；栓線由北京沙東生物技術有限公司提供，線身直徑026mm，頭端包被多聚賴氨酸，線頭直徑036±002mm，線長40mm，和球端相距19～20mm處有黑色標記。

13方法

131術前準備實驗前對大鼠適應性喂養(yǎng)一周，自由飲水進食。術前12h禁食，自由飲水。3℅水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，頸前區(qū)備皮，常規(guī)消毒。

132模型制備Zea Longa線栓法組[4]：參照Zea Longa線栓法制備大鼠MCAO模型，頸正中線切口，鈍性分離，暴露右側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的三角區(qū)域，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離肌肉筋膜，暴露頸總動脈（CCA），頸外動脈（ECA），頸內(nèi)動脈（ICA）。電凝器電凝ECA的分支，結扎翼腭動脈（PPA），并在ECA近心端、遠心端分別穿線，遠心端系緊，近心端系一松結備用， 用微動脈夾暫時夾閉CCA與ECA，在ECA的兩線間剪一小口，將栓線經(jīng)小口插入頸外動脈并送入頸內(nèi)動脈；改良線栓法組[5]：頸正中切口，暴露右側(cè)CCA、ICA和ECA，電凝ECA與ICA之間的交通支，結扎并游離ECA，確保ECA殘端長度不少于05 cm。以微動脈夾暫時阻斷CCA及ICA血流，用眼科剪于ECA 殘端作一縱行小切口，將線栓從右側(cè)ECA殘端插入ICA，輕輕牽拉ECA殘端，使其與ICA成一條直線，調(diào)整線栓角度，使線栓弧度水平向外，與頸前正中線呈45度水平向外的夾角，移去夾閉ICA的動脈夾，輕輕將線栓送入顱內(nèi)，栓塞成功后，結扎ECA殘端，移去CCA上的微動脈夾，觀察無活動性出血后關閉切口。新式線栓法組：頸正中線切口3～4cm，鈍性分離，暴露右側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的三角區(qū)域，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離肌肉筋膜，暴露CCA，在CCA的近心端和遠心端分別穿線，近心端系緊，距此節(jié)1cm處的遠心端系一松節(jié)備用，在CCA近ICA分叉處以微動脈夾暫時夾閉，在CCA的兩線間，距CCA分叉處5mm左右，剪一斜行45°小口，松開分叉處微動脈夾進行插線，在栓線標記接近CCA與ICA分叉處或遇阻力感時停止。

133神經(jīng)功能評分參照Garcia神經(jīng)功能評分[6]標準，評價大鼠的神經(jīng)行為學，包括以下6項：自主運動；四肢運動對稱性；前爪伸展性；攀爬運動；肢體本體感覺；觸須反應。采用雙盲法于術后24小時評分并記錄。

134TTC染色及腦梗死體積率測定 于缺血再灌注24h后麻醉剪下頭部，取出腦組織，置于腦模具中，沿視交叉向后平均切成5片，將其放入2%TTC的磷酸鹽緩沖液，于37℃溫箱中染色30min，再用4%多聚甲醛固定并攝片。

135觀測指標記錄從切口至插入栓線模型制作的時間；分析動物死亡原因，統(tǒng)計死亡率；于造模24h后對存活大鼠進行神經(jīng)功能評分，統(tǒng)計模型成功率；用Image-Pro-Plus軟件測量TTC染色后腦梗死體積率。

136模型成功標準神經(jīng)功能評分為4～12 分，存活超過24h，取大腦無蛛網(wǎng)膜下腔出血，大腦冠狀切面TTC染色可見明顯蒼白梗死區(qū)者為造模成功。

137統(tǒng)計學分析各組計量資料均采用SPSS190統(tǒng)計學軟件進行處理，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”（x±s）表示，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時進行單因素方差分析，不呈正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗。

2結果

21大鼠死亡情況Zea Longa線栓法組大鼠共10只，死亡5只，存活5只，其中2只疑因造模時間過長，在造模完成后2h內(nèi)死亡，3只在24h內(nèi)死亡，解剖有蛛網(wǎng)膜下腔出血。改良線栓法組大鼠10只，死亡3只，存活7只，1只因大失血死亡，2只在造模完成后24h內(nèi)死亡，解剖一只有嚴重腦水腫，一只蛛網(wǎng)膜下腔出血。Zea Longa線栓法組大鼠死亡率為50%，改良線栓法組大鼠為30%。新式線栓法組大鼠10只，存活10只，但有一只因栓線反復進退致血管痙攣，導致栓線深度未達到，造模失敗，但沒有大鼠死亡。就大鼠死亡情況而言，新式線栓法組優(yōu)于Zea Longa線栓法組和改良線栓法組。

22模型制作時間、神經(jīng)功能評分、腦梗死體積率實驗結果表明，新式線栓法組與Zea Longa線栓法組和改良線栓法組比較，神經(jīng)功能評分、腦梗死體積率差異無統(tǒng)計學意義（P>005）；造模時間比較，新式線栓法組的模型制作時間最少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）

3討論

線栓法因為各種優(yōu)點，成為了廣大研究者最為青睞的方法之一。為了使模型成功率更高，更穩(wěn)定，廣大研究者對線栓法進行了諸多改進。筆者在傳統(tǒng)線栓法的基礎上，查閱相關文獻，經(jīng)反復實踐并總結諸多改良線栓法，對線栓法進行了進一步改良，僅需分離一根血管，打兩個手術結，夾一個微動脈夾，使模型的制作時間和大鼠的死亡率明顯低于Zea Longa線栓法組和現(xiàn)有的改良線栓法組，進一步確保的模型制作的穩(wěn)定?，F(xiàn)將模型制作中的相關經(jīng)驗探討如下，以期對各科研者有所幫助。

31大鼠的選擇SD大鼠與Wistar大鼠差異不大，但是SD大鼠出血更少。選擇SD大鼠使手術操作更容易[7]。因為雌激素對大腦具有保護作用，故選擇雄性大鼠。低于250g的大鼠，血管太細，容易刺破血管，死亡率高，超過300g的大鼠的血管過粗，容易造成栓塞不完全，認為大鼠體重控制在250～300g為佳。

32線栓的選擇栓線的選擇主要有尼龍線和魚線兩種，制作方法主要有石蠟包被，硅膠包被，多聚萘胺酸包被，也有用指甲油包被的。我們主要采用多聚賴氨酸包被的漁線，購買成品，規(guī)格更為一致，對模型的影響因素更小。

33麻醉劑的選擇選用3%的水合氯醛1ml/100g，安全有效。5分鐘內(nèi)起效，但是維持時間較短。需要在50min左右加補水合氯醛，劑量一般為總劑量的1/3。

34切口及分離的部位關于切口，廣大研究者主要有三種觀點：正中切口，右側(cè)切口，右側(cè)斜向正中切口。筆者選用正中切口，鈍性分離，暴露右側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的三角區(qū)域，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離肌肉筋膜，暴露頸總動脈，頸外動脈，頸內(nèi)動脈。視野清晰，出血少，損傷相對較小，通常1～2min即可完成，用時短。

35栓線的入路僅分離頸總動脈一根血管，有效降低了手術操作時間；在頸總動脈（CCA）的近心端和遠心端分別穿線，近心端系緊，距此節(jié)1cm處的遠心端系一松節(jié)備用；在頸總動脈（CCA）和頸內(nèi)動脈（ICA）的分叉處以微動脈夾夾閉，僅使用一個動脈夾，大大減少了手術的損傷；在頸總動脈的兩線間剪一斜行的45°小口進行插線，切口具有一定傾斜角度更有利于插線；在分離頸總動脈分叉處時，可提拉遠心端的松節(jié)，更利于暴露交感神經(jīng)干，以避免對其刺激，降低大鼠的死亡率，確保模型的穩(wěn)定性。尤其適用于線栓法操作尚不熟練的研究者。

36術中大鼠的護理我們在長期的實踐中發(fā)現(xiàn)，術中大鼠死亡的原因主要有三種：一是呼吸急促。原因可能與分離血管時牽拉甚至損傷迷走神經(jīng)有關。僅分離頸總動脈近分叉處1mm的血管，可以有效減少對迷走神經(jīng)的刺激及損傷；此外，采取分離血管前局部浸潤利多卡因，使用剝離分針代替鑷子，小心分離，有利于暫時降低迷走神經(jīng)的敏感性，并且，在分離頸總動脈分叉部時可稍向上提拉頸總動脈遠心端的松結，有利于避免刺激頸動脈竇，改善大鼠呼吸急促的問題。二是呼吸困難，主要與麻醉有關。首先麻醉后大鼠的舌部麻醉腫脹，術前應將大鼠舌部稍牽拉出并偏向一側(cè)，以免堵塞氣道。其次水合氯醛易增加呼吸道的分泌物，尤其造成痰液過多，文獻報道麻醉前可適量注射阿托品（1支稀釋成10ml，每只01ml）。但是，事實上，阿托品[8]是通過阻斷M受體的作用抑制腺體分泌，會使氣道分泌物變粘稠，而不是減少分泌，反而更容易形成痰痂，阻塞氣道，效果不佳。我們采取密切觀察，在大鼠有呼吸困難或者痰鳴音時予以吸痰處理，效果穩(wěn)定。三是大出血，傳統(tǒng)線栓法因為要從頸外動脈插線，故要分離并電凝其分支兩到三條?，F(xiàn)有的改良線栓法雖然不從頸外動脈插線，但是要結扎頸外動脈，有時也會涉及到頸外動脈與頸內(nèi)動脈之間的分支。這些分支一旦破裂，極易造成大出血，導致大鼠因失血過多而死亡。而且頸總動脈分叉處有頸動脈竇，分離極易過度刺激神經(jīng)或者造成損傷，增加大鼠的死亡率。我們改良的線栓法，因為只需要分離頸總動脈一條，故而避免了分支破裂而造成的出血，也避開了頸總動脈分杈處的分離，減少了動物的死亡率及造模失敗的危險性。

37術后大鼠的護理造模完成后，栓線抽出，將松結系緊。局部使用抗生素浸潤，避免感染。先縫合肌肉層再縫合皮膚。解除固定后，若大鼠還未清醒，還可對大鼠四肢及腹部進行按摩。術后24h大鼠宜單獨喂養(yǎng)。

線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注的模型雖然得到了廣泛的認可，技術發(fā)展也日益成熟，但是由于影響模型成功的因素很多，如何規(guī)范和優(yōu)化手術操作，降低動物的死亡率，使大鼠的腦梗塞恒定，更能模擬人類的發(fā)病機理，仍是廣大研究者亟待解決的問題，仍需要科研者不斷探索總結，為建立更加穩(wěn)定的模型而努力。

參考文獻

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[8]凌保東.藥理學[M].北京：高等教育出版社，2003：59.

（收稿日期：20131201）