張碧麗，郁曉騰

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是由于腎小球濾過膜對血漿蛋白的通透性增高、大量血漿蛋白從尿中丟失而導致一系列病理生理改變的臨床綜合征，以大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥和水腫為主要臨床特點，目前發(fā)病機制尚未完全闡明?；蛐酒夹g(shù)是20世紀90年代初期發(fā)展起來的綜合了分子生物學、半導體微電子技術(shù)、激光化學、計算機科學等眾多學科的一門高新技術(shù)，其依據(jù)核酸分子雜交原理檢測待測樣品的基因序列及表達的信息，具有高通量、集成化、微型化及自動化的特點[1-2]。目前基因芯片已經(jīng)發(fā)展出多種類型，如Oligo芯片、mRNA表達譜芯片、microRNA芯片、cDNA芯片及DNA甲基化芯片等，涉及基因表達檢測、藥物靶點篩選、新基因識別及基因功能研究等眾多研究領(lǐng)域。高興等[3]利用基因芯片技術(shù)進行多種食源性致病菌的篩查檢測，得出隨機引物PCR聯(lián)合基因芯片技術(shù)進行食源性致病菌檢測的體系完全可行，為病原細菌高通量篩查提供了新的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。尹豐等[4]利用基因芯片技術(shù)篩選人腦膠質(zhì)瘤細胞（GSCs）和正常神經(jīng)干細胞（NSCs）中差異表達的基因，揭示了GSCs和NSCs在mRNA表達水平的差異，由mRNA所控制的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡對NSCs向GSCs的惡性轉(zhuǎn)化具有重要影響，為探索腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生機制及靶向治療提供了線索?；蛐酒夹g(shù)可以從基因水平分析NS的致病機制和藥物治療的作用靶點。本文主要對基因芯片技術(shù)在NS中的研究應用進行綜述。

1 基因芯片技術(shù)的原理及與高通量測序技術(shù)的比較

基因芯片技術(shù)的具體程序是把大量已知基因序列探針集成于同一張芯片，將經(jīng)過標記后的靶核苷酸序列與之雜交，通過檢測雜交信號，對待測樣品中的基因信息進行高通量的分析[5]。高通量測序技術(shù)是近年來發(fā)展起來的另外一種高通量基因組學研究方法，也稱其為深度測序技術(shù)[6]。與高通量測序技術(shù)比較，基因芯片技術(shù)具有技術(shù)穩(wěn)定、雜交結(jié)果分析直觀、快速等優(yōu)點，其缺點在于基因芯片技術(shù)只能檢測已知序列的特征，沒有發(fā)現(xiàn)新信息的能力。近幾年發(fā)展起來的Target-sequencing或者稱為序列捕獲技術(shù)，先利用芯片探針捕獲待測片段，再用深度測序技術(shù)分析核酸序列，充分綜合了兩者的優(yōu)勢，解決了單一技術(shù)難以解決的問題[7-8]。

2 基因芯片技術(shù)在NS研究中的應用

目前認為NS的發(fā)生是由多基因參與的復雜過程。因此，在探索NS發(fā)病機制的過程中，能否將NS相關(guān)致病基因作為一個整體進行研究，成為解決這一問題的關(guān)鍵。基因芯片技術(shù)可實現(xiàn)在mRNA水平上同時平行研究成千乃至上萬條基因的表達關(guān)系，為揭示NS的發(fā)病機制提供了有力工具。

2.1 基因芯片技術(shù)與微小病變性腎病（MCNS） MCNS是兒童NS中最常見的病理類型。有學者認為MCNS是由于免疫細胞的功能障礙，可能導致腎小球致通透性因子的釋放[9]。Komatsuda等[10]利用包含24 446個cDNA的微陣列，檢測2例MCNS患者腎病活動期和緩解期外周血單個核細胞（PBMC）mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)在腎病活動期有171個功能已知的基因表達發(fā)生了上調(diào)，其中21個基因編碼的蛋白可參與信號轉(zhuǎn)導和細胞因子的反應，通過qRT-PCR驗證24例MCNS患者、10例膜性腎?。∕N）患者和24例健康對照者，證實MCNS患者PBMC中趨化因子13（CCL13）和半乳糖凝集素相關(guān)蛋白（hspc159）的mRNA表達均明顯高于MN患者和健康對照組。大量研究表明，CCL13參與許多炎癥性疾病，其通過與受體結(jié)合選擇性趨化炎性細胞并調(diào)控關(guān)鍵的激活程序，推測其可能與MCNS患者的免疫炎癥反應有關(guān)[11]。hspc159屬于凝集素家族，可以調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子的平衡，Th1/Th2細胞因子的平衡失調(diào)被認為參與了許多自身免疫性疾病，推測hspc159的高表達與MCNS患者Th2細胞為主的免疫反應有關(guān)[12]。組蛋白賴氨酸甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，被認為參與了多個生物學過程，組蛋白賴氨酸甲基化模式的異常改變，使得染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可進一步導致失調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄和疾病進展。Zhang等[13]采用ChIP-chip試驗方法檢測15例MCNS患者和15例正常對照者PBMC組蛋白H3賴氨酸4甲基化（H3K4me3）后基因表達的變化，發(fā)現(xiàn)MCNS組有841個基因表達上調(diào)、231個基因表達下調(diào)，采用qRT-PCR驗證了表達明顯上調(diào)的白細胞介素（IL）-4受體（R）、prkd2基因，與芯片結(jié)果一致，揭示了這些基因mRNA的表達和H3K4me3水平呈正相關(guān)關(guān)系。IL-4R基因編碼IL-4R的α鏈，通過與IL-4結(jié)合促進Th2細胞的分化，而prkd2屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，其在多種細胞表達，調(diào)節(jié)包括免疫反應在內(nèi)的多種細胞反應，并且prkd2對內(nèi)皮細胞的增殖和遷移起著重要作用，這些顯著變化的基因有助于解釋MCNS患者免疫功能紊亂[14-15]。此外，還發(fā)現(xiàn)H3K4me3和MCNS患者啟動子DNA甲基化之間存在負相關(guān)關(guān)系[13]。Kobayashi等[16]利用DNA甲基化芯片分別檢測6例MCNS患者緩解期、復發(fā)期的外周血的單核細胞和Th細胞，結(jié)果顯示從緩解期到復發(fā)期DNA甲基化模式主要發(fā)生在Th細胞，GATA2、PBX4和NYX 3個基因的表達顯著降低，表明表觀遺傳調(diào)控Th細胞是MCNS的發(fā)生機制。

以上研究表明，T淋巴細胞基因的異常表達導致細胞免疫功能障礙，引發(fā)腎小球濾過膜通透性改變，參與了NS的發(fā)病。利用基因芯片技術(shù)篩選差異性表達基因，并探討各個基因之間的相互關(guān)系和作用，是最終闡明NS發(fā)病機制和尋找藥物治療靶點的關(guān)鍵。

2.2 基因芯片技術(shù)與局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS） 近年來，兒童FSGS的發(fā)病率一直在增長，是導致兒童慢性腎衰竭的重要原因。研究認為FSGS的發(fā)生和足細胞損傷或數(shù)目減少有關(guān)[17]。足細胞表達許多特殊的蛋白分子，如nephrin、CD2AP、Podacalycin等，這些蛋白的編碼基因突變或缺失可以導致足細胞的結(jié)構(gòu)和功能改變[18-19]。Jeffrey等[20]通過比較FSGS患者、MCNS患者及正常人的基因表達譜變化，發(fā)現(xiàn)FSGS組較MCNS組、正常組有316個基因表達發(fā)生顯著差異，其中nephrin的表達下降近2倍，足細胞特異性肌動蛋白相關(guān)蛋白（Synaptopodin）表達下降近3倍，還有一些構(gòu)成足細胞裂孔隔膜（SD）復合體的分子，如FAT1、MAGI2和TJP1的表達同樣降低，證實足細胞結(jié)構(gòu)改變與FSGS的發(fā)生密切相關(guān)。通過聚類分析，揭示這些基因的功能涉及細胞周期與細胞增殖、細胞骨架與運動、細胞信號轉(zhuǎn)導等多個方面，細胞增殖周期中轉(zhuǎn)錄因子的再激活和過表達很可能與FSGS發(fā)病機制有關(guān)[20]。Bennett等[21]研究發(fā)現(xiàn) FSGS患者 NPSH1、WT1、nephrin、ACTN4等足細胞相關(guān)基因表達明顯下調(diào)，進一步證實足細胞損傷與FCGS發(fā)生密切相關(guān)。同時有研究證實血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的下降與蛋白尿有關(guān)，而轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β信號通路表達增強[20]。目前研究證實，TGF-β信號通路表達增強可導致腎臟纖維化的進展[23]。另有研究表明，激素抵抗性腎病綜合征和TGF-β1的表達上調(diào)有密切關(guān)系[24]。目前TGF-β1已被公認是治療腎小球硬化的靶點。有研究表明血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）類藥物可以下調(diào)TGF-β1的表達，達到干預FSGS進展的作用[25]。

2.3 基因芯片技術(shù)與膜性腎病（MN） MN是成人NS中最常見的病理類型，以基底膜彌漫性增厚及上皮下免疫復合物沉積為特征，其發(fā)病機制目前仍不明了。Sui等[26]利用基因芯片技術(shù)研究MN與正常人PBMC組蛋白H3賴氨酸9（H3K9me3）甲基化修飾后的變化，發(fā)現(xiàn)MN患者有108個基因表達發(fā)生了明顯變化，通過qRT-PCR驗證了DGCR6、SNX16、CNTN4、BIRC3、BIRC2 基因表達明顯上調(diào)，與芯片結(jié)果一致，其中CNTN4編碼黏附蛋白，屬于免疫球蛋白家族的成員。另有研究顯示CNTN4基因表達上調(diào)，可能與MN免疫復合物沉積有關(guān)[27]，為探討MN的發(fā)病機制及治療提供了方向。Wu等[28]以胎齡6周的BALB/c小鼠為研究對象，模型組予以陽離子化的牛血清白蛋白（C-BSA）造成MN，利用基因芯片分別檢測模型組和對照組小鼠腎皮質(zhì)，結(jié)果模型組有175個基因呈顯著差異性表達，從中篩選出4個與損傷、炎癥、細胞基質(zhì)相互作用有關(guān)的基因MT-1、CTSD、lamr-1和LY6進行PCR驗證，與芯片結(jié)果一致。其中LY6在以往的研究中被證實和蛋白尿的發(fā)生及狼瘡腎損害有關(guān)[29]；而CTSD編碼的組織蛋白酶D正常情況下分布于遠端腎小管和集合管系統(tǒng)，其表達增加可見于鏈球菌感染后腎小球腎炎[30]。王琳等[31]利用Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0探索特發(fā)MN患者全基因組拷貝數(shù)變異（CNVS）與參芪膜腎方療效的關(guān)系，觀察到參芪膜腎方治療有效組和無效組在第5、6、8號染色體檢測到的CNVS差異有統(tǒng)計學意義，其中位于6號染色體上的HLA族基因在有效組多數(shù)病例中表現(xiàn)為拷貝數(shù)擴增，而無效組的多數(shù)病例則表現(xiàn)為拷貝數(shù)缺失，得出基因背景差異可能是導致參芪膜腎方取得不同療效的原因，HLA的同族基因拷貝數(shù)變異影響參芪膜腎方療效的發(fā)揮，前者有望成為該方治療MN的療效預測因子。

2.4 基因芯片技術(shù)與系膜增生性腎小球腎炎 系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）是以不同程度的系膜區(qū)增寬、系膜細胞增生、系膜基質(zhì)增多為主要病理特征的腎小球疾病。通過給大鼠靜脈注射單克隆抗Thy-1抗體模擬慢性腎小球腎炎模型，可以觀察到腎小球系膜及系膜細胞的顯著增殖，類似MsPGN[32]。Sadlier等[33]利用Oligo芯片分別檢測注射抗Thy-1抗體后第0、2、5、7、14天大鼠腎皮質(zhì)基因表達譜，發(fā)現(xiàn)在第5天PDGF、TGF-β等促細胞增殖基因的表達顯著增加，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)了新的促系膜細胞增殖基因S100家族。Tsuji等[34]利用基因芯片技術(shù)比較不可逆模型組（靜脈注射1-22-3抗體并切除單側(cè)腎臟）、可逆模型組（單純靜脈注射1-22-3抗體）大鼠之間差異表達基因，檢測出有189個基因發(fā)生差異表達，而且大多數(shù)的差異基因發(fā)現(xiàn)于第4天，提示基因表達的早期變化決定了疾病的不可逆性，其中胸腺肽-β10在不可逆組顯著表達，推測腎臟疾病發(fā)生的共同機制可能涉及間質(zhì)纖維化和巨噬細胞浸潤。Hong等[35]通過芯片檢測模型組大鼠在不同時間點基因表達譜的變化來研究DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子KLF-15對腎小球系膜細胞的影響，結(jié)果表明KLF可能通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白E2F1的表達抑制腎小球系膜細胞的增殖，其可作為治療系膜增生性腎小球腎炎的一個靶點。

3 問題與展望

基因芯片技術(shù)經(jīng)過近20余年的快速發(fā)展，已經(jīng)成為了一個非常穩(wěn)定可靠的實驗技術(shù)，并展現(xiàn)出其快速性、高效性、準確性的優(yōu)勢。這一技術(shù)在腎臟疾病發(fā)生機制的研究及藥物治療靶點的篩選中發(fā)揮著重要作用，但仍存在一些問題需要完善，比如，如何降低芯片的成本，如何簡化實驗流程，提高檢測結(jié)果的特異性等。隨著研究的深入和這些問題的不斷解決，基因芯片技術(shù)將在腎臟疾病的研究中發(fā)揮更重要的作用。

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