孫曉麗，朱毅，2△

細胞膜脂筏結構蛋白質組與血管內(nèi)皮細胞功能調(diào)控

孫曉麗1，朱毅1，2△

動脈粥樣硬化發(fā)病起始于內(nèi)皮細胞功能紊亂，在動脈粥樣硬化病因學方面的工作集中在脂質代謝和炎癥反應兩個方面。內(nèi)皮細胞膜表面脂筏結構參與到內(nèi)皮細胞許多重要的生理功能中：感受細胞內(nèi)膽固醇水平并參與膽固醇代謝，感受并傳導血流剪切力信號，為許多信號分子相互作用提供平臺。本文主要針對細胞膜脂筏結構蛋白質組與血管內(nèi)皮細胞功能調(diào)控進行綜述。

脂筏；蛋白質組學；膽固醇；他汀類，流體剪切力；內(nèi)皮功能紊亂

1 脂筏與動脈粥樣硬化

1.1 脂筏、小凹（caveolae）與小凹蛋白（caveolin）“脂筏”是細胞膜上具有獨特結構和功能的亞細胞器，參與細胞的胞吞、胞飲作用，膽固醇的轉運和信號轉導，其內(nèi)富含膽固醇、鞘磷脂、糖鞘脂、?；拾贝肌⑻腔字＜〈?，不溶于非離子型去污劑。當細胞高表達caveolin時，脂筏結構向內(nèi)凹陷形成小凹結構，即caveolae。Caveolae是50～100 nm大小，呈倒置Ω形狀的細胞表面小凹［1］。脂筏中的脂類和蛋白質間的相互作用對caveolae結構的形成起關鍵作用。因此，cave?olae是脂筏的特殊結構，在本文中筆者將脂筏和caveolae等同討論。

Caveolin是caveolae的主要結構蛋白，對維持caveolae的凹型結構至關重要。其中caveolin-1（α、β亞型）和caveo?lin-2（α、β、γ亞型）主要存在于內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、上皮細胞、和Ⅰ型肺細胞，而caveolin-3主要存在于各種肌細胞、星形膠質細胞和軟骨細胞。在每個內(nèi)皮細胞表面大約有5 000～10 000個caveolae［2-3］。在內(nèi)皮細胞中，脂筏參與細胞的胞吞、胞飲、膽固醇的轉運和信號轉導，是細胞的信號處理中心，具有廣泛的調(diào)節(jié)信號轉導作用［4］。

1.2 脂筏與細胞膽固醇膽固醇是脂筏結構必不可少的成分。細胞膜上的膽固醇占細胞內(nèi)游離膽固醇含量的90%，而脂筏的膽固醇含量又遠高于胞膜其他部位。膽固醇對維持脂筏的結構和功能起重要作用。脂筏是細胞膽固醇含量的感受器，介導膽固醇的內(nèi)流和外流。脂筏的結構蛋白caveo?lin-1是膽固醇結合蛋白，參與膽固醇的轉運。脂筏和caveo?lin的上調(diào)或下調(diào)與細胞游離膽固醇的外流呈平行關系。無論是新合成的膽固醇還是再循環(huán)的、經(jīng)過加工的膽固醇都被選擇性地運送到脂筏。Caveolin-1可與熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）56、親環(huán)素40、親環(huán)素A和膽固醇形成復合物，這一復合物被稱為HSP-親免素伴侶復合物，它可以結合新合成的膽固醇，并將其從內(nèi)質網(wǎng)轉運至胞膜脂筏。棕櫚酰化是caveolin-1與膽固醇的結合、caveolin-伴侶轉運復合物的形成及膽固醇向脂筏轉運所必需的［5］。脂筏/caveolae可以內(nèi)陷形成囊泡進入細胞內(nèi)并與其他膜結構融合。

1.3 脂筏與內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide syn?thase，eNOS）NO是保護動脈的關鍵信號分子，具有促進血管舒張、抑制血小板聚集和黏附、抑制平滑肌細胞增生及單核細胞黏附于內(nèi)皮的作用。內(nèi)皮源性NO是由eNOS催化L-精氨酸轉化為L-瓜氨酸的過程中生成的［6］。NO生成的減少增加了中性粒細胞黏附于內(nèi)皮的作用，促進內(nèi)膜的損傷，是高膽固醇血癥誘導的血管病變和動脈粥樣硬化早期發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮細胞NO產(chǎn)生的異常導致內(nèi)皮細胞的功能失常，可作為動脈粥樣硬化發(fā)生的前奏。

eNOS高度富集于脂筏內(nèi)，對脂筏與其底物（L-精氨酸、NADPH、氧）、輔因子（Ca2+、四氫生物蝶呤、黃素）和調(diào)節(jié)蛋白（鈣調(diào)素）的相互作用十分重要，同時脂筏對eNOS活性的調(diào)節(jié)也十分重要。在caveolae內(nèi)，caveolin-1的腳手架結構域、N-末端和C-末端胞漿結構域都可與eNOS的N-末端氧化酶結構域結合，使eNOS-caveolin復合物定位于脂筏，并干擾eNOS與Ca2+/鈣調(diào)素的相互作用而發(fā)生可逆性的抑制其活性作用。

在靜息狀態(tài)下，caveolin-1抑制eNOS的活性，各種刺激［如緩激肽、凝血酶、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、鈣離子載體、血流的增加及剪切應激］誘導細胞Ca2+內(nèi)流，細胞內(nèi)Ca2+的增加使鈣調(diào)素代替caveolin與eNOS結合，eNOS進入胞漿內(nèi)并活化。當細胞內(nèi)的Ca2+恢復到基礎水平，鈣調(diào)素與eNOS分離，eNOS重新與caveolin結合返回胞膜脂筏，使eNOS失活。HSP90可以促進eNOS與caveolin-1解離而與鈣調(diào)素結合，從而減弱caveolin-1對eNOS的抑制作用，增加eNOS的活性及NO的產(chǎn)生。

1.4 脂筏與胰島素受體信號轉導在脂肪細胞中，胰島素受體作為跨膜受體蛋白，主要分布于脂筏當中，與caveolin-1相互結合，功能被抑制，胰島素刺激引起其磷酸化依賴于完整的脂筏結構。Caveolin-1敲除小鼠存在嚴重的胰島素抵抗和高胰島素血癥。

1.5 脂筏與自由基NADPH廣泛分布于動脈粥樣硬化相關細胞（巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞）的脂筏結構中，脂筏結構為自由基產(chǎn)生所必須的結構蛋白組裝提供平臺［7］。在內(nèi)皮細胞中，腫瘤壞死因子（TNF）-α、Fas配體、內(nèi)皮抑素均能刺激脂筏聚集，并激活NADPH，促進氧化反應發(fā)生，破壞內(nèi)皮依賴的血管收縮。

1.6 脂筏與機械信號轉導脂筏能感受并傳導流體剪切力產(chǎn)生的機械信號，是動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。脂筏介導了流體剪切力調(diào)節(jié)的NO依賴的血管舒張，在機械信號誘導的內(nèi)皮細胞的極性調(diào)節(jié)、細胞遷移中也是不可缺少的。有研究報道，脂筏結構的完整性在流體剪切力刺激下的依賴于ATP的鈣離子信號中扮演著不可缺少的角色［8］。

有研究發(fā)現(xiàn)，敲除caveolin-1的小鼠可以存活，但細胞表面的脂筏結構消失，細胞內(nèi)吞受損、過度增殖，在整體上表現(xiàn)出肺泡間隔增厚［9-10］；血管中表現(xiàn)為eNOS及整合素功能失調(diào)［11-12］，血管內(nèi)皮與基底膜黏附異常，血管舒縮功能受損，血管滲透性增加［13］；右心室擴大、左室壁增厚、心肌肥大及纖維化［14-15］；免疫反應缺陷、抗感染能力下降［16］；胰島素抵抗和高胰島素血癥［17］。

Caveolin-1敲除小鼠的動脈粥樣硬化發(fā)生率降低，ca?veoin-1和載脂蛋白（Apo）E雙敲小鼠血中，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）升高2倍，但動脈斑塊卻減少70%，CD36和血管細胞黏附分子（VCAM）-1表達量減少，恢復caveolin-1表達會增加斑塊面積，其機制可能是：caveolin-1的缺失增加NO產(chǎn)生、減少LDL-c侵入血管壁及抑制白細胞黏附分子表達［18-19］。

有研究表明，破壞細胞骨架，影響其對脂筏結構的支撐作用后，小鼠的動脈粥樣硬化反而被加重［20］，原因可能是由于脂筏對不同蛋白的功能存在非常復雜的調(diào)節(jié)，敲除caveo?lin-1或破壞脂筏結構往往引起多條信號通路的變化，并不能完全說明脂筏結構在動脈粥樣硬化中扮演的角色。因此，對脂筏蛋白進行高通量研究對于進一步系統(tǒng)地理解脂筏結構在動脈粥樣硬化中的作用十分重要。

2 膽固醇與脂筏蛋白質組學

高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化的重要危險因素，當血漿LDL-c水平升高時可以調(diào)節(jié)細胞游離膽固醇，與內(nèi)皮脂筏介導的膽固醇外流有關。以前的研究表明LDL-c可以引起Ras、eNOS及caveolin-1向脂筏轉位，并伴有這些蛋白的功能改變［21-22］。

為系統(tǒng)研究膽固醇對脂筏內(nèi)蛋白質的調(diào)節(jié)，筆者所在課題組用功能蛋白質組學的方法研究了游離膽固醇對內(nèi)皮細胞脂筏內(nèi)相關蛋白轉位的影響：用游離膽固醇處理內(nèi)皮細胞4 h后，用蔗糖密度梯度離心的方法提取脂筏蛋白，并用雙向電泳技術分離其內(nèi)蛋白質，然后用質譜技術對差異蛋白進行分析，結果發(fā)現(xiàn)雙向電泳凝膠上檢測的40組蛋白點中，ATP合酶α、β鏈和78 ku的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP78）被上調(diào)，而ATP合酶D鏈，β/γ-actin和Annexin 42被下調(diào)。筆者對雙向電泳所得的質譜結果進行了驗證，并進一步發(fā)現(xiàn)ATP合酶β鏈感受到膽固醇刺激后，與caveolin-1發(fā)生結合，并通過細胞骨架滑行由細胞內(nèi)線粒體向細胞膜上轉位，釋放更多的ATP，并使磷酸腺苷依賴的蛋白激酶（AMPK）磷酸化增加，對內(nèi)皮細胞的功能起保護作用。該發(fā)現(xiàn)為內(nèi)皮細胞能量代謝和膽固醇轉運之間的關系提供了新的證據(jù)［23］。筆者后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)流體剪切力對細胞膜表面的膽固醇有調(diào)節(jié)作用：致動脈粥樣硬化的流體形式（體外采取洄流進行模擬）能夠增加內(nèi)皮細胞膜表面的膽固醇含量；反之，抗動脈粥樣硬化的流體形式（體外采取層流進行模擬）則能減少內(nèi)皮細胞膜表面膽固醇的含量，這與高膽固醇和洄流致動脈粥樣硬化是一致的。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ATP合酶β鏈同時還能感受流體剪切力刺激并對內(nèi)皮細胞功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。結果證實層流和去除膽固醇均能促進ATP合酶β鏈自脂筏向線粒體轉位，而洄流和膽固醇處理則能促使其自線粒體向脂筏轉位，而ATP合酶β鏈向脂筏中轉位的生理意義在于其作為一組特異性T淋巴細胞亞群——γ/δT細胞表面受體（TCR）的特異性配體介導γ/δT細胞與內(nèi)皮細胞在高膽固醇和洄流刺激下結合，釋放炎癥因子，從而誘導內(nèi)皮細胞功能紊亂［24］。

筆者另一項研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生炎癥反應的內(nèi)皮細胞中，內(nèi)皮細胞表面細胞間黏附分子（ICAM）-1被上調(diào)，并主要分布于脂筏當中，當受到高膽固醇的刺激后，膽固醇競爭性地抑制ICAM-1與caveolin-1結合，使得ICAM-1從脂筏中被釋放出來，并發(fā)揮其黏附作用，促進了內(nèi)皮細胞表面單核細胞的黏附［25］。

3 脂筏的定量蛋白質組學研究

同一種蛋白在不同亞細胞器的定位直接影響其功能，作為信號分子整合的平臺，脂筏廣泛分布在不同種類的細胞膜表面，研究其內(nèi)部蛋白質的定位、功能及變化非常必要。

運用液相色譜與質譜連用的定量蛋白質組學的方法，筆者分析了阿托伐他汀和不同形式流體剪切力（脈動流和洄流）處理后內(nèi)皮后脂筏中的蛋白質轉位情況。發(fā)現(xiàn)在不同刺激下，300多種蛋白質均發(fā)生了轉位，其中包括已報道的ATP合酶β鏈。筆者將所得到的大量蛋白質進行功能分類，并挑選其中受調(diào)節(jié)顯著，并可能與動脈粥樣硬化發(fā)病相關的蛋白質進行進一步分析，結果顯示，阿托伐他汀引起內(nèi)皮細胞中ERp46向脂筏轉位，從而加強ERp46與Nox2的相互作用，進而發(fā)揮著抗氧化作用［26］。而在脈動流和洄流刺激的內(nèi)皮細胞中，筆者挑選了整合素α5進一步研究，結果發(fā)現(xiàn)，不同剪切力反向調(diào)節(jié)其在細胞骨架和caveolin-1介導下脂筏內(nèi)的轉位，抑制或激活其功能，影響其泛素化水平，進而反向調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞炎癥反應。在整合素敲除小鼠中也表現(xiàn)出洄流引起的內(nèi)皮炎癥反應減輕的表型（待發(fā)表）。

內(nèi)皮細胞脂筏結構在動脈粥樣硬化中扮演多方面角色。一方面，脂筏廣泛分布于內(nèi)皮細胞膜上，能感受到來自外界環(huán)境的多方面刺激，如血中膽固醇、炎癥因子、胰島素等的水平，血流動力學改變等，是內(nèi)皮表面的信號感受器，能感受外界環(huán)境的變化并傳遞信號幫助細胞作出相應的反應。另一方面，作為蛋白質整合平臺，脂筏內(nèi)存在大量的信號分子，參與整合復雜的信號通路傳導。

脂筏結構復雜，富含脂質、caveolin結構蛋白，這些都能從各方面影響其功能，不同的信號通路在動脈粥樣硬化發(fā)病中扮演者復雜甚至相反的角色，因此，不同手段破壞脂筏結構（如敲除caveolin-1、去除膽固醇等），在疾病模型中可能存在不同的表型。未來對于脂筏的研究，可能需要結合蛋白質組學、脂質代謝組學、形態(tài)學研究等多平臺手段進行系統(tǒng)研究，在不同疾病、不同外界環(huán)境刺激中發(fā)現(xiàn)更特異的機制，為有針對性地疾病預防和治療提供依據(jù)。

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（2015-07-14收稿2015-07-30修回）

（本文編輯閆娟）

R543.5，R363

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.004

國家自然科學基金重點資助項目（81130002）

1北京大學醫(yī)學部生理學與病理生理學系；2天津醫(yī)科大學生理學與病理生理學系

孫曉麗（1987），女，博士，主要從事血流動力學改變與內(nèi)皮細胞功能調(diào)控的研究

△通訊作者E-mail：zhuyi@tijmu.edu.cn