張樹建，張輝，詹江華

RET基因甲基化在先天性巨結(jié)腸發(fā)生機制中的作用

張樹建，張輝，詹江華△

目的研究原癌基因RET的甲基化與先天性巨結(jié)腸（HD）之間的關(guān)系，了解其在腸壁神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生發(fā)展中的意義。方法選取天津市兒童醫(yī)院診治的HD手術(shù)切除病變組織標本21例為試驗組，均為擴張段；同期非HD患兒正常結(jié)腸組織標本5例，為對照組。應用亞硫酸氫鹽測序法（BSP）直接檢測方法檢測RET的CpG島甲基化狀態(tài)，用免疫組織化學方法檢測試驗組和對照組中RET蛋白的表達情況。結(jié)果試驗組RET的CpG島有12例（57.14%）發(fā)現(xiàn)甲基化，對照組標本均未發(fā)現(xiàn)甲基化。12例甲基化RET的蛋白表達的平均光密度為0.201±0.015，低于9例非甲基化RET的蛋白表達的平均光密度，為0.364±0.023，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論RET基因甲基化可能通過影響RET蛋白的表達水平，影響神經(jīng)節(jié)細胞的發(fā)育，從而參與HD的發(fā)生。

Hirschsprung??；原癌基因蛋白質(zhì)c-ret；免疫組織化學；甲基化

先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung’s disease，HD）是一種常見的消化道發(fā)育畸形，發(fā)病率為1∶5 000。HD的發(fā)生機制主要與原癌基因RET、EDNRB突變，以及腸道神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的內(nèi)環(huán)境有關(guān)［1］。原癌基因RET是目前HD的最關(guān)鍵基因，參與神經(jīng)脊細胞的定向遷移［2］。表觀遺傳學（甲基化、乙?；?、磷酸化和泛素化等不改變堿基序列的可逆性修飾）是近年來的研究熱點［3］。本研究通過檢測HD患兒病變組織標本原癌基因RET甲基化狀態(tài)及其擴張段蛋白水平的表達差異，旨在探討原癌基因RET啟動子上游CpG島與HD發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料選自天津市兒童醫(yī)院2010年1月—2012年3月診治的HD患兒21例為試驗組，年齡2 d～11歲，其中男19例，女2例，均為散發(fā)，否認家族史；均經(jīng)手術(shù)和病理診斷為HD。其中正常段所取部位經(jīng)病理證實神經(jīng)節(jié)細胞正常，且擴張段腸管為全層組織。對照組選取我院同期非HD患兒5例，年齡5個月～8歲，男3例，女2例，結(jié)腸重復畸形3例，結(jié)腸淋巴管瘤2例。

1.2方法

1.2.1實驗儀器DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司），DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司），YXJ-2離心機（湘儀離心機儀器有限公司），H6-1微型電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius公司），U-3010紫外-可見分光光度計（Hitachi公司），PCR反應擴增儀、移液器（范圍100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL）（加拿大BBI公司）；組織脫水機ASP200（Leica Microsystems GmbH），石蠟包埋機BMJ-1（天津天利航空機電有限公司），石蠟切片機M1210（Thermo Shandon Ltd），烤箱（SANYO Electric Co.Ltd），微波爐（格蘭仕集團有限公司），烤片機（Leica），冰箱（三洋），光學顯微鏡（Olympus）和計算機圖像分析系統(tǒng)（Leica Microsystems Wetz?lar GmbH 020-519.010LB30T，Germany）等。

1.2.2主要試劑NaHSO3（分析純）、NaOH、氫醌、TaqDNA聚合酶及dNTP、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（SK1261）均購自上海生工生物工程有限公司；粘片劑：0.1 g/L多聚賴氨酸溶液，購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人RET免疫組化多克隆抗體（北京博奧森公司）；即用型非生物素廣譜二抗（上海長島生物技術(shù)有限公司）。DAB顯色試劑盒：購于上海長島生物技術(shù)有限公司，包括A瓶（DAB底物緩沖液）、B瓶（DAB色原）。常規(guī)試劑：蘇木素染液、伊紅染液；0.01 mol/L PBS（pH7.2～7.4）；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 7.6）等。

1.2.3亞硫酸氫鹽測序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）26例標本全層結(jié)腸組織各30 μg行DNA的提取和純化；DNA亞硫酸氫鈉修飾：約2 μg DNA于1.5 μL EP管中使用DDW稀釋至50 μL，加5.5 μL新鮮配制的3 mol/L NaOH，42℃水浴30 min。加10 mmol/L對苯二酚（氫醌）30 μL至上述水浴后混合液中，溶液變成淡黃色，加520 μL 3.6 mol/L亞硫酸氫鈉至上述水浴后溶液中。EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。加200 μL石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化，50℃避光水浴16 h；修飾后DNA純化回收。RET基因甲基化PCR擴增引物，上游5′-TGGGGGAAA ATTGGATTTTTTTTTTTTTTT（CT）GT-3′，下游5′-ACTTA?CAATCCCTACCTTTTACCCTTTCC（AG）C-3′，產(chǎn)物長度為485 bp，且RET有26個CpG島。內(nèi)參為GAPDH，上游5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游5′-CATGT?GGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。反應體系為50 μL，其中DNA 3 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，dNTP 1 μL，Taq Buffer 10×PCR Buffer（with Mg2+）5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.8 μL，水38.2 μL。PCR反應條件：98℃4min，94℃45s，66℃45s，72℃1min，每個循環(huán)退火溫度遞減0.5℃，20個循環(huán)。94℃45 s，56℃45 s，72℃1 min，20個循環(huán)，72℃8 min。PCR電泳與回收參照試劑盒SK1261。檢測結(jié)果得出各組甲基化樣本數(shù)。

1.2.4HE及免疫組織化學染色方法應用HE染色證實神經(jīng)節(jié)細胞存在，免疫組化染色RET。免疫組化染色方法：常規(guī)切片厚5 μm，脫蠟至蒸餾水，再用0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復，3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后加入稀釋好的一抗，4℃過夜。二抗采用SP試劑盒，DAB顯色，蘇木素復染，最后脫水透明后封片。

1.3結(jié)果判定（1）定性判定：光鏡下發(fā)現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為陽性反應，其密度與部位即為RET表達的多少與分布，本實驗選擇肌間神經(jīng)叢，計算機成像系統(tǒng)攝取圖像，存盤。（2）定量判定：在相同放大倍數(shù)的顯微鏡下拍攝的圖片中，病理切片均隨機取腸壁肌間神經(jīng)叢3～7個高倍鏡視野，有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師進行陽性染色結(jié)果鑒定，計算機圖像分析軟件（Im?age-Pro-Plus）分別計算3～5個視野中的神經(jīng)叢中棕黃色染色的平均光密度，再取其平均數(shù)。

1.4統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)處理用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包，計量資料用表示，兩獨立樣本均數(shù)比較采用t檢驗；甲基化率的比較采用Fisher’s確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1HE在腸神經(jīng)叢的染色情況試驗組擴張段與對照組中典型的神經(jīng)節(jié)細胞容易辨認，見圖1、2。

2.2免疫組化染色結(jié)果在HD擴張段中，甲基化與非甲基化RET基因表達蛋白陽性染色均在細胞漿彌漫出現(xiàn)，在細胞膜有陽性染色。腸壁肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢內(nèi)均可見RET陽性表達，見圖3、4。

2.3BSP直接測序結(jié)果21例HD病變組織標本有12例（57.14%）發(fā)生甲基化，5例陰性對照組標本均未發(fā)現(xiàn)甲基化，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.042）。

2.4免疫組化染色圖像分析RET蛋白在HD擴張段的神經(jīng)叢中12例甲基化樣本的平均光密度為0.201±0.015，9例非甲基化樣本的平均光密度為0.364±0.023，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.269，P＜0.05）。

3 討論

RET作為一個跨膜酪氨酸激酶受體，并且還是神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）家族的受體，被證明是引起HD的主要基因［2］。RET基因定位于10q11.2區(qū)，長約80 kb，有20個外顯子，其編碼產(chǎn)物RET蛋白是一種酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）受體，其基本功能是將細胞外信息轉(zhuǎn)變?yōu)閭魅爰毎麅?nèi)的化學信號，對腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起重要的作用。

基因的表觀遺傳學對DNA的甲基化修飾研究較早，提出正常的甲基化對于維持細胞的生長及代謝等是必需的，異常的DNA甲基化則會引發(fā)疾?。ㄈ缒[瘤），因為異常的甲基化一方面可能使抑癌基因無法轉(zhuǎn)錄，另一方面也會導致基因組不穩(wěn)定［3-4］。DNA甲基化在基因表達上的調(diào)控作用是導致基因的失活，即基因沉默。這種調(diào)控作用從本質(zhì)上說是一種DNA水平的調(diào)控，從效果上說是直接影響基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化也可以促進基因突變，產(chǎn)生編碼蛋白數(shù)量的減少或蛋白質(zhì)功能異常，導致細胞發(fā)生缺失或功能異常。既往研究表明RET缺失突變可引起RET受體蛋白水平或活性降低，從而影響RET配體GDNF的磷酸化活性和生物功能、組織神經(jīng)嵴源性細胞的正常發(fā)育，導致HD［5］。多數(shù)對RET原癌基因的研究是關(guān)于其突變誘導疾病產(chǎn)生，GDNF/RET信號傳導通路在腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展過程中扮演了非常重要的角色［6］。該通路主要是對腸神經(jīng)脊細胞的擴增、分化及遷移有至關(guān)重要的作用。

本研究結(jié)果表明，21例標本中12例發(fā)現(xiàn)甲基化，甲基化標本RET的蛋白表達的平均光密度較非甲基化組低，由此可見RET甲基化致其蛋白的表達下降，進而可能導致HD發(fā)生，這與Hindorff等［7］的實驗結(jié)果一致。Uesaka等［8］發(fā)現(xiàn)，當小鼠RET基因表達水平降為原來的50%時，會出現(xiàn)類似于HD樣無神經(jīng)節(jié)細胞腸段。基于此，筆者推測，甲基化修飾是一種不改變DNA堿基序列的可逆性基因表達調(diào)控過程，其啟動子上游富含CpG島區(qū)域可能主要干擾mRNA的合成，進而影響rRNA，導致蛋白表達水平下降。RET基因甲基化致其mRNA表達水平下降到一定程度后才有可能導致RET基因的表達沉默，進而形成HD，但相關(guān)理論還有待進一步證實。

總之，對RET基因甲基化研究的深入會對HD的發(fā)病機制有更進一步了解。DNA甲基化是一種高于基因組序列水平的基因表達調(diào)控機制，其在表觀基因組水平精確研究正常和疾病組織DNA甲基化模式的特征和差異，揭示如腫瘤、HD等疾病的表觀遺傳學機制，并將DNA甲基化模式的改變與基因沉默、年齡相關(guān)變化和疾病特異性改變聯(lián)系在一起，將是一個有前景的研究領(lǐng)域。

（圖1～4見插頁）

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（2014-10-14收稿 2015-02-10修回）

（本文編輯 魏杰）

The role of RET proto-oncogene methylation in the pathogenesis of Hirschsprung's disease

ZHANG Shujian，ZHANG Hui，ZHAN Jianghua△
Department of Surgery，Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300074，China△

ObjectiveTo investigate the relationship between the methylation of RET（proto-oncogene，RET）and Hirschsprung disease（HD），and understand its significance in the development of intestinal wall ganglion cells.Methods Twenty-one surgical removal specimens，which were all dilation segment of HD in Tianjin Children’s Hospital，were used as experimental group，and 5 samples of non-HD normal colon tissues were used as control group.The bisulfite sequencing（BSP）-direct detecting method was used to detect RET CpG island methylation status.The expression of RET protein wasdetected by immunohistochemistry in experimental group and control group.ResultsIn the experimental group 12 cases（57.14%）were found methylation，but no methylation was found in control group.The average optical density of methylated RET protein was 0.201±0.015 in 12 cases.The average optical density of un-methylated RET protein was 0.364±0.023 in 9 cases（P＜0.05）.ConclusionRET CpG island methylation reduced protein expression levels of RET.The corollary RET gene methylation may influence the expression levels of RET protein，thereby affecting the ganglion cell development，and thus participating in the occurrence of HD.

Hirschsprung disease；proto-oncogene proteins c-ret；immunohistochemistry；methylation

R574.62

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.015

天津市兒童醫(yī)院外科（郵編300074）

張樹建（1983），男，碩士研究生，主要從事先天性巨結(jié)腸方面研究

△通訊作者E-mail:zhanjianghuatj@163.com