楊丹丹，羅　雪，王潤芳，任小苗，馬　迪，張紫薇(綜述)，王　艷(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科一病房，哈爾濱150001)

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量子點的單分子生物成像

楊丹丹△，羅雪△，王潤芳△，任小苗△，馬迪△，張紫薇△(綜述)，王艷※(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科一病房，哈爾濱150001)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.038

量子點是直徑在納米范圍(直徑通常為2～10 nm)內的熒光半導體，其最新研究使量子點或量子點納米晶體在生物分子及細胞成像上的應用成為可能。盡管量子點具有高度疏水性、毒性及與生物分子不相容性，但其獨特的性能價值超過目前已知的有機染料和熒光蛋白：寬的激發(fā)光譜、可調和窄的發(fā)射譜及抗漂白能力。生物分子和細胞成像的第一個步驟就是功能化兩親配體的疏水表面。雖然功能化的兩親配體的大小大于原來的非涂布狀態(tài)(2.0～9.5 nm)，但這些涂層的量子點基本上對細胞是無毒的，且其治療上的應用已有報道[1]。該文簡要回顧量子點作為熒光探針標記細胞、量子點的DNA診斷及單個生物分子探測的生物學應用，并討論其實現(xiàn)單分子分析的前景。

1量子點的屬性

量子點是直徑為幾納米的單晶體材料，一般由不同類型的半導體材料合成，如硒化鎘、磷化銦、碲化鎘及砷化銦等。不同成分、不同尺寸的量子點提供不同的體積帶隙能量并發(fā)射出特定波長的光，有代表性的是直徑為2.0～9.5 nm的量子點發(fā)射400～1350 nm波長的光[2-3]。目前已允許通過控制合成條件來精確控制量子點的大小，這些合成的量子點的核心和核心-殼由于其疏水表面，因此只溶于非極性有機溶劑。

應用量子點作為生物成像的新型熒光探針，其生物相容性是最重要的挑戰(zhàn)。在過去的幾年中，應用了各種策略使量子點溶解在水溶液的緩沖區(qū)。硫醇(-SH)包含的分子常用來固定量子點表面的功能基團群[4-5]，親水末端，如羧基(-COOH)使量子點變?yōu)樗苄訹6]，低聚的膦[7]、樹狀分子[8]以及肽分子[9]等可以選擇性改變量子點表面性質。與這些共價修飾方法相反，可采用兩親性聚合物涂層或包裹，如二嵌段[10]或三嵌段共聚物[11]、磷脂膠束[12]和多糖[13]。量子點在水中的溶解性和穩(wěn)定性達到滿意后，下一需求則將面向生物分子探針和活細胞，包含某種識別分子功能化量子點表面(如DNA寡核苷酸、RNA、肽、抗體等)。

許多方法可使生物分子與量子點共軛，如非特異性吸附量子點表面的簡單水溶性小分子物(寡核苷酸[14-15]以及各種血清白蛋白[16]等)。這些非特異性吸附可以很容易地產生生物分子共軛物，但其表面狀態(tài)也易被環(huán)境影響，如離子強度、pH值以及溫度等。帶負電荷的量子點可與帶正電域的蛋白融合共軛[6]，這為胺基修飾的量子點與羧基修飾的生物分子特異性及穩(wěn)定性吸附提供可能[2,4,8,17-20]，其中最常用的修飾是鏈霉親和素涂層的量子點結合生物素化的寡核苷酸[12,14-15,20]、蛋白質[21]以及抗體[4,10,22-24]等。這些功能流程可重復，使量子點成為多能熒光探針。雖然通過功能層的形成可使量子點尺寸變大，但沒有證據表明，共軛的生物分子的生物學功能被量子點干擾。因此，量子點也能作為有機染料。

2量子點作為探針在細胞生物學中的應用

量子點在細胞生物學中最為成功的應用是用作免疫熒光標記細胞和組織。研究人員基于量子點作為熒光探針已經進行了各種研究，如膜蛋白質[10,25-28]、微管[10]、肌動蛋白[2,10]及核抗原的膜染色[10]。由于量子點的信號本質上比有機染料強，而且能表現(xiàn)出較長時間的光穩(wěn)定性和耐光漂白性，使量子點成為理想的探針。量子點所具有的一些光物理性質也使其具有局限性，其中之一是量子點在發(fā)光狀態(tài)與非發(fā)光狀態(tài)間的轉變所引起的閃爍。量子點這種不連續(xù)的熒光限制了其應用，特別是在單分子范圍內的應用。然而，在某些情況下，這種不連續(xù)發(fā)射有助于從人工免疫細胞化學實驗中區(qū)分量子點信號。最近，Hohng和Ha[29]的研究表明，量子點閃爍可以被含巰基鈍化表面的量子點抑制。這種防閃爍研究能夠長期軌跡跟蹤單一的量子點連接，并擴大其能力，便于研究膜蛋白或基因轉運到細胞質和細胞核等。Hoang等[3]的研究表明，抗生物素蛋白受體在HeLa細胞的細胞質膜上的表達可以被生物素化的肽涂層量子點標記，并可在單一分子水平觀察到這種結合物。這種方法可以揭示細胞膜上糖基錨受體與脂筏之間的關系。量子點也可用于藥物和基因傳遞系統(tǒng)的單量子點信號偶聯(lián)。在大多數情況下，官能化量子點帶有合適的天線(如有針對性的肽序列)，可使其聚合在內涵體。Szymanski等[30]研究表明，顯微注射允許發(fā)送包含功能肽序列的量子點到線粒體和細胞核。

3量子點的毒性

隨著碳納米材料，如碳納米管和富勒烯的急劇膨脹，量子點的細胞毒性已被提出，特別是在活細胞實驗中。由于材料、合成方法、增溶作用以及量子點的官能化協(xié)同使量子點毒性問題變得非常復雜。大部分報道發(fā)現(xiàn)，適當應用親水殼涂層時，硒化鎘量子點對細胞活力、形態(tài)及功能沒有急性和明顯的毒性[22,31]；但是當量子點表面涂層缺乏或Cd2+被釋放時，細胞毒性可能發(fā)生，如硒化鎘暴露于空氣可被氧化或損壞[31]。因此，在量子點表面涂層、防止氧化損傷是活細胞和動物實驗的關鍵。因此，需要進一步研究以闡明量子點共軛物的安全性，以便安全地進行量子點在下一個階段的應用。

4量子點DNA探針的基因組分析

熒光原位雜交技術是一種重要的以核酸為基礎的技術，其能夠在細胞內可視化和映射遺傳物質。該技術一般提供基因或部分基因的具體定位，以及腫瘤細胞中異?；驍U增的基因拷貝數的定量信息。常用的有機染料在熒光圖像量化之前迅速被光漂白，而且當目標數目有限時檢測更困難，更為嚴重的問題是細胞固有的自體熒光降低了信號噪聲比。量子點具有足夠的耐光性、寬的激發(fā)波譜以及窄的發(fā)射波長范圍，因而是一種非常具有應用前景的有機染料。Xiao等[32-33]采用鏈霉素連接硒化鎘量子點，通過熒光原位雜交技術分析人類染色體和SK-BR-3乳腺癌細胞系。此外，Luo等[5]采用熒光原位雜交技術對人類精子細胞中的Y染色體進行了檢測。量子點不僅可以對人類染色體進行檢測，也可以對大腸埃希菌進行檢測，量子點探針可與pUC18質粒的多個克隆位點進行序列互補[34]。量子點為基因組分析技術應用于臨床診斷提供了可能。

5量子點的單分子探針

分析科學的終極目標之一是單分子分析，試圖只從單個分子中讀出各種分子的信息。量子點因其獨特的光物理性質，即光譜范圍、亮度、長壽命等是實現(xiàn)單分子分析的潛力探針。這些特性使量子點單分子探針能長期跟蹤，適用于在體內研究蛋白質動力學配體轉運。量子點相對較大的尺寸、高電子密度等屬性可作為分子來標記與它們結合的生物分子，并使其熒光。有研究人員在實驗中利用原子力顯微鏡和電子顯微鏡，應用單量子點跟蹤研究甘氨酸受體的快速橫向動力學[35-36]。明亮的量子點能夠觀察到突觸外和突觸域的多個交換，其中包括甘氨酸受體在自由基與密閉擴散狀態(tài)之間轉變。為了量化觀察結果，研究人員確定了單量子點跟蹤導致的瞬時擴散系數。此外，通過電子顯微成像可觀察和明確甘氨酸受體擴散進入到突觸。利用表面功能多樣性和發(fā)射光譜窄，構建了多種顏色量子點修飾的DNA，并應用于現(xiàn)有的DNA診斷技術中，如SNP分型[37]、點突變的檢測、單個DNA水平的DNA-蛋白質相互作用研究[38-40]。盡管已經揭示了人類基因組序列，但是更重要的是要觀測何時、何種蛋白結合到DNA的何種部位并調制表達，這可采用熒光研究評估或結合熒光及靜態(tài)成像技術評估，如原子力顯微鏡或電子顯微鏡，其不同于傳統(tǒng)的有機染料，當量子點在DNA末端標記時，可進行DNA-蛋白質相互作用的動態(tài)研究?；谒鼈兊南鄬Ω呙芏群痛蟮谋砻娣e，預計會有更多重要的應用。

6結語

前文討論了量子點的性質以及作為新型熒光探針在生物學的應用。目前，在細胞生物學中已經建立了一些量子點染色方法，但是量子點作為單分子探針的單分子分析仍然具有挑戰(zhàn)性。雖然量子點的獨特的光物理和形態(tài)特性為生物學研究提供了一個方法，但不會取代傳統(tǒng)有機染料或熒光蛋白。

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摘要：半導體量子點(量子點)是納米尺度的晶體，其具有獨特的光物理性質，如熒光壽命較長、對光漂白有獨特的穩(wěn)定性、較大的帶隙位移及狹窄對稱的熒光譜峰，這些特性使量子點成為有前途的生物光學標記，如作為免疫熒光標記細胞和組織、DNA探針及單分子探針等。量子點可用于標記DNA序列或電化學檢測蛋白質。該文就量子點的屬性與毒性及其光學與電化學生物的分析應用，尤其是量子點在生物醫(yī)學中的應用予以綜述。

關鍵詞：量子點；熒光探針；毒性

Study on Single Bio-Molecule Imaging of Quantum DotsYANGDan-dan,LUOXue,WANGRun-fang,RENXiao-miao,MADi,ZHANGZi-wei,WANGYan.(FirstGynecologicalWard,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract:Semiconductor quantum dots are nanometre-scale crystals,which have unique photophysical properties,such as longer fluorescence lifetime,unique stability on photobleaching,and larger bandgap displacement and narrow symmetrical fluorescence spectra peak.Such properties enable quantum dots to be the promising optical labels for the biological applications,such as immunofluorescence labeling of cells and tissues,DNA probe and single-molecule probes.Meanwhile,quantum dots can also be used as labels for the electrochemical detection of DNA or proteins.Here is to make a review of the properties and toxicity of quantum dots and their analytical applications in optics and electrochemical biology,especially the application of quantum dots in the area of biomedicine.

Key words:Quantum dots; Fluorescent probe; Toxicity

收稿日期：2014-01-10修回日期：2014-07-21編輯：辛欣

中圖分類號：R114

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)05-0871-03