侯橙 宋福強 劉雪峰 董愛榮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (黑龍江大學(xué)) (東北林業(yè)大學(xué))

野生樺褐孔菌的鑒定及ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析1)

侯橙 宋福強 劉雪峰 董愛榮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (黑龍江大學(xué)) (東北林業(yè)大學(xué))

依據(jù)子實體的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性，對采自黑龍江省大興安嶺呼中國家級自然保護區(qū)的野生藥用真菌進行了鑒定。結(jié)果表明：該菌PCR擴增產(chǎn)物長761 bp。ITS序列聚類結(jié)果表明，該菌種與Inonotusobliquusisolate FS656163以及Inonotusobliquusstrain MDJCBS88同源性最近，為樺褐孔菌的不同菌株，而與Inonotuslinteusstrain PL08121和Inonotusrickiiisolate PF241親緣性最遠，都屬于纖孔菌屬。結(jié)合分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)鑒定，一致確定其為樺褐孔菌(Inonotusobliquus)。

樺褐孔菌；形態(tài)學(xué)；ITS

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)屬真菌門(Eumycota)擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)層菌綱(Hymenomycetes)非褶菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae)纖孔菌屬[1]，俗稱樺癌褐孔菌、白樺茸、斜管纖孔菌，歐洲人稱之為chaga[2]，是一種具有很高藥用價值、應(yīng)用前景廣泛的真菌，可用于治療各種消化道癌癥、降血糖、防治艾滋病、抗衰老、降血脂、降血壓，還能夠改善過敏體質(zhì)，增強免疫力[3]。樺褐孔菌主要寄生于白樺(Betulaplatyphylla)、銀樺(Grebillearobusta)、榆(Ulmuspumila)、赤楊(Alnusjaponica)等落葉樹活立木的樹皮下或倒木枯干上，形成不育的木腐菌，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存6年之久，菌絲體耐受低溫能力極強。該菌主要分布于北緯45°～50°地區(qū)的苦寒地帶，如俄羅斯、中國黑龍江大小興安嶺、吉林省長白山、北美北部及日本北海道[4-5]。

傳統(tǒng)的真菌分類鑒定主要是依據(jù)子實體的形態(tài)特征，其優(yōu)點是鑒定方法簡單，鑒定結(jié)果直觀，缺點是無法對只有菌絲體的菌種材料進行直接的鑒定，而分子鑒定方法可以對菌絲體材料進行直接的鑒定。此研究基于前人對該屬真菌部分種類ITS序列的測序結(jié)果，對樺褐孔菌進行了形態(tài)學(xué)鑒定和ITS序列PCR擴增，并構(gòu)建了纖孔菌屬真菌的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育聚類樹。

1 材料與方法

1.1 標本采集

2011年5月份，在大興安嶺呼中國家級自然保護區(qū)原始白樺林內(nèi)，以散點法尋找無病蟲害、生長年數(shù)超過5 a的子實體，利用鐮刀、斧子等工具在樹木表面采集，采集深度為樹木表層1～3 cm，并對子實體拍照、編號，記錄子實體形態(tài)特征。將子實體保持完整裝入標本盒中，采回后立即用PDA平板分離純化培養(yǎng)。

1.2 菌種分離與純化

采用傘菌分離法，首先用無菌棉球沾無菌水擦掉子實體表面的木屑，75%的酒精對子實體表面消毒，然后在超凈臺中徒手掰開子實體，用消毒的解剖刀在深部生長部位割取組織，迅速放入滅菌的虎紅固體培養(yǎng)基，封口后置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3日后將純菌轉(zhuǎn)入PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，每日觀察菌落生長狀況記錄拍照。同時轉(zhuǎn)接到試管斜面上，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，長滿后置冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)子實體、菌絲體生長特征，參照戴玉成的《中國東北野生食藥用真菌圖志》、卯曉嵐的《中國大型真菌》對其進行觀察對照。徒手切片后，顯微鏡下觀察真菌菌絲體及菌落形態(tài)、大小、色澤等特征[6-7]。

1.4 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

菌絲體總DNA提取：菌種用打孔器轉(zhuǎn)接至PDA液體培養(yǎng)基里28 ℃、120 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，搖培結(jié)束后將培養(yǎng)液離心，取菌絲體，菌絲體經(jīng)去離子水水洗，再離心，這樣重復(fù)操作幾次，收集菌絲體。采用改良的CTAB法提取樺褐孔菌基因組總DNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量[8]。

PCR擴增：采用ITS-rDNA通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，以所提取菌種的DNA為模板，按照表1反應(yīng)體系冰上操作擴增ITS區(qū)。

表1 25 μL ITS-rDNA擴增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)反應(yīng)；循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物純化、克隆及測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗后采用TaKaRa Fragment Purification Kit(TaKaRa，Cat. No. DV807A)純化，過程按操作手冊進行。分光光度計檢測純化產(chǎn)物濃度，按目標片段與載體pGEM-T Easy Vector(promega，Prod.No.A1360)的質(zhì)量比為1∶3的比例建立連接體系，4 ℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并涂布于X-gal/IPTG LB平板上過夜。挑取白色菌落，PCR擴增法初步篩選陽性克隆后送上海生物工程有限公司測序。

數(shù)據(jù)分析：將測定的ITS-rDNA序列用軟件DNA-MAN進行序列拼接，登錄http//:www.ncbi.nlm.nih.-gov，用BLAST程序與GenBank中的ITS序列進行同源性比較，并把相關(guān)的序列下載，將測得的序列和下載的序列進行完全對比，將獲得的ITS-rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫并獲得登錄號，選擇同源性較近的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合文獻報道，通過ITS序列比對，序列相似性大于或等于99%時，判斷為同種；序列相似性介于95%至99%之間，判斷為相同屬；序列相似性小于或等于95%，判斷為相同科[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

從大興安嶺呼中國家級自然保護區(qū)采集回來的野生樺褐孔菌子實體呈黑褐色不規(guī)則瘤狀，表面堅硬，質(zhì)地硬脆，子實體外部較干，用斧子砍開切面處手感濕潤。菌肉木栓質(zhì)，有模糊不清的環(huán)紋，淡黃褐色(圖1)。

圖1 樺褐孔菌子實體

PDA固體平板中培養(yǎng)7 d的菌落上的菌絲濃厚、整齊，從中心向四周生長；菌落中心顏色呈黃褐色，從中心至邊緣黃色逐漸變淡，外圍純白色；平板背面菌落有明顯的淺褐色環(huán)紋(圖2)。菌種接到PDA液體培養(yǎng)基，在柜式恒溫搖床中120 r·min-1，28 ℃下培養(yǎng)7 d，菌球邊緣呈尖刺狀；搖瓶壁上的菌絲帶變粗，部分被搖落到液體中；搖瓶中液體顏色由淡黃色逐漸變?yōu)樯詈稚?，脫落的菌絲結(jié)合為圓形或卵形菌絲球(圖3)。挑取平板的營養(yǎng)菌絲體壓片后在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲呈半弧形，透明，絲狀。營養(yǎng)菌絲多分枝，可見菌絲橫隔，無鎖狀聯(lián)合。

圖2 樺褐孔菌平板分離

圖3 樺褐孔菌菌球

2.2 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育

應(yīng)用改良的CTAB法提取到樺褐孔菌的基因組DNA片段，經(jīng)電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)照相，得到基因組DNA電泳圖譜，在15 000 bp附近出現(xiàn)基因組條帶(圖4)。用通用引物ITSI和ITS4對樺褐孔菌基因ITS-rDNA片段進行PCR擴增，經(jīng)電泳檢測，擴增后產(chǎn)生單一清晰的條帶，可供進一步的純化與克隆。4個樺褐孔菌菌株的PCR擴增產(chǎn)物平行樣擴增后的片段長度都在750 bp左右(圖5)。

圖4 樺褐孔菌的基因組DNA

本研究采集的野生菌株的ITS-rDNA經(jīng)測序獲得的目的片段長度為761 bp，包含18S rDNA部分序列，306 bp ITS1序列全長，160 bp 5.8S rDNA全長，243 bp ITS2全長，以及部分28S rDNA序列。在GeneBank上經(jīng)BLAST比對，與Inonotusobliquus的ITS-rDNA序列有99%的相似性，結(jié)合形態(tài)觀察，確定所采的野生菌種為樺褐孔菌。序列已提交NCBI上的EST庫，其在GenBank上的登陸號為：KC312697(GI:461725870)，核苷酸序列(5′→3′)如下：

GACTCCTGATTTGAGGTcAaAGGTGTCAAGAAG

GCCCAACGAAGGGATCCTTGTCCAACTTAAGGACT

ATTAGAAGCAGACTTGTTAGGCAAGCGTCTTAGTG

AACATTACATTATTACACCGTAAACGCGAACCAAA

GTCCAGCTAATGTATTTGAGAGGAGCCGACAAACC

AAGGGCAACCAAAGTCGCCCGGGCCAGCAAAACC

TCCAAGTCCAAATCGAAAGCCACTTCAATTAAGAA

TAGACGAGCGATTTGAGATTAACATGACACTCAAA

CAGGCATGCCCCTCGGAATACCAAGGGGCGCAAGG

TGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCA

ATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCAT

CGATGCGAGAGCCTAGAGATCCGTTGTTGAAAGTT

GTATTTATTATCGCCCACAAGGAGCATTTCATTCAC

ATAACAATTATATTGGTGTTTGTAATGAAGCCAAAA

GCTTTTCGTCTCCTTGTCTCTGAAGCTTGCCTTTCCA

TCTTTCACACTTTCCAAGGGCCGAAACCCTCGTACT

TGATTACTCGACGTACTTGACTTGCCGTTCGATTAC

AGAAACTACTAAGACCTTCAACTTGTATAGGTGCAC

AGGGGTTTGAGAGTTGGATTTGAGCACGAAAGGCC

GTGCACATGCAAACGTTTCCGTGCCAGCACAGGCC

CCTCGATTTCAAAATAAACTCGATAATGATCCTTCC

GCAGGTTCACCTACGGAA

圖5 樺褐孔菌ITS-rDNA PCR擴增結(jié)果

通過BLAST軟件的分析，對樺褐孔菌菌株測得的序列和GenBank中下載的ITS-rDNA序列進行聚類分析，應(yīng)用MEGA5.03軟件建立基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。從圖6可以看出，采集的菌種目標序列與InonotusobliquusisolateFS656163以及InonotusobliquusstrainMDJCBS88同源性最近，這2個為樺褐孔菌不同菌株，而與InonotuslinteusstrainPL08121和InonotusrickiiisolatePF241親緣性最遠，二者都屬于纖孔菌屬。

圖6 基于ITS-rDNA的樺褐孔菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 結(jié)束語

本研究應(yīng)用可靠便捷的ITS-rDNA序列分析方法對1株野生樺褐孔菌菌株進行分類鑒定。在鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，同一科下不同屬的近緣菌株序列都具有較高的同源性，來自不同地區(qū)的菌株在ITS區(qū)具有很高的相似性，需要結(jié)合其他的分析方法如形態(tài)特征來進行綜合評價。本研究以ITS-rDNA為遺傳標記，系統(tǒng)發(fā)育比對結(jié)果顯示此野生菌株與樺褐孔菌(Inonotusobliquus)有99.0%的相似度。應(yīng)用PCR等傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法，結(jié)合該菌株子實體形態(tài)特征、菌絲生長情況和顯微鏡檢等形態(tài)學(xué)觀察，參照《中國東北野生食藥用真菌圖志》、《中國大型真菌》的相關(guān)描述，最終確定此野生菌株為樺褐孔菌(Inonotusobliquus)。ITS-rDNA測序結(jié)果為761 bp，已經(jīng)提交至NCBI上的EST庫，其在GenBank上的序列號為：KC312697(GI:461725870)。

[1] 林碧賢,李曄,毛景華,等.藥用真菌白樺茸：樺褐孔菌[J].海峽藥學(xué),2004,16(6):74-76.

[2] 卯曉嵐.中國大型真菌資源及其評價[J].西北植物學(xué)報,1989,9(1):52-61,68.

[3] 黃年來.俄羅斯神秘的民間藥用真菌：樺褐孔菌[J].中國食用菌,2002,21(4):7-8.

[4] 梁清樂,王秋穎,樊錦燕,等.樺褐孔菌的研究概況[J].中草藥,2005,36(4):623-625.

[5] 陳體強,吳錦忠.珍稀藥用菌：樺褐孔菌的研究進展[J].海峽藥學(xué),2005,17(2):1-3.

[6] 戴玉成,圖力古爾.中國東北野生食藥用真菌圖志[M].北京:科學(xué)出版社,2007:95.

[7] 卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社,2000:465.

[8] 陳艷秋.樺褐孔菌菌株遺傳多樣性及人工培養(yǎng)條件優(yōu)化模式研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[9] Landeweert R, Leeflang P, Kuyper T W, et al. Molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons[J]. Applied and Environmental Microbiology,2003,69(1):327-333.

Diagnosis and ITS Phylogenetic Analysis ofInonotusobliquus//

Hou Cheng

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P.R. China); Song Fuqiang(Heilongjiang University); Liu Xuefeng, Dong Airong(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2015,43(9)：128-130,133.

On the basis of the fruiting body morphology and its cultural characteristics, we identified the wild medicinal fungi collected from Daxing’an Mountains Huzhong National Nature Reserve of Heilongjiang Province. The length of the PCR product was 761 bp. We took the phylogenetic analysis of the ITS region forInonotus. The phenogram inferred from the alignment showed thatI.obliquuswas evolutionarily closely related to isolate FS656163 and strain MDJCBS88, and evolutionarily the furthest related toI.linteusstrain PL08121 andI.rickiiisolate PF241. By the molecular and morphological identification, we identified the species asI.obliquus

Aphelenchoidesbesseyi; Morphology; ITS

1)國家林業(yè)局公益性項目(201004079)。

侯橙，女，1992年5月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail：624477196@qq.com。

董愛榮，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，副教授。E-mail：darlmy@tom.com。

2015年3月25日。

S718.81

責(zé)任編輯：程 紅。