孫婷玉

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

葉建仁 吳小芹 朱麗華 吳靜 梁芬

(南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心) (江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點實驗室(南京林業(yè)大學(xué))) (南京林業(yè)大學(xué))

責(zé)任編輯:程 紅。

黑松(Pinus thunbergii)原產(chǎn)日本，為海岸綠化樹種之一，在我國遼東半島、山東、江蘇、浙江和臺灣均有栽培，但由于其高度感染松材線蟲病(Bursaphelenchus xylophilus)使得受害十分嚴(yán)重［1］。因此，培育出具有抗松材線蟲病的黑松苗木對解決該問題具有重要意義。組織培養(yǎng)技術(shù)可以不受季節(jié)和地域的限制，快速高效地繁殖基因優(yōu)良的樹種。組織培養(yǎng)技術(shù)可分為器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生。目前國際上普遍認(rèn)為體細(xì)胞胚胎發(fā)生是針葉樹良種基因型規(guī)模化擴繁的最佳途徑［2］。體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有繁殖速度快、數(shù)量多、結(jié)構(gòu)完整、植株再生率高等特點［3］，對優(yōu)良基因型具有無限擴繁的潛力。體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系中需要經(jīng)過胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性愈傷組織的增殖、體細(xì)胞胚的成熟和萌發(fā)等階段，其中胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］。自Hakman et al.［5］首次報道由歐洲云杉(Picea abies)未成熟合子胚培養(yǎng)物中獲得體細(xì)胞胚并再生出植株以來，針葉樹的體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究已不斷取得令人矚目的進(jìn)展。我國針葉樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究開展雖然相對較晚，但是也取得了很大的進(jìn)展。黃健秋等［6-7］利用馬尾松(Pinus massoniana)、云南松(P.yunnanensis)成熟合子胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得體細(xì)胞胚;唐巍等［8-9］分別利用火炬松(P.taeda)、濕地松(P.elliottii)成熟合子胚通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑實現(xiàn)植株再生;申曉輝等［10］用紅松(P.koraiensis)未成熟合子胚首次建立了紅松體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)體系;李清清［11］等用黑松未成熟合子胚建立了黑松體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)體系;吳靜等［12］首次在國內(nèi)誘導(dǎo)出了抗松材線蟲病赤松(P.densiflora)的胚性愈傷組織。而目前，國內(nèi)尚無有關(guān)抗松材線蟲病黑松體細(xì)胞胚胎發(fā)生的相關(guān)報道。本研究以抗松材線蟲病黑松未成熟合子胚為外植體，對抗性黑松胚性愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行了研究，以期提高抗性黑松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率;為抗性黑松體細(xì)胞胚胎發(fā)生提供研究材料，以獲得抗性黑松苗木;這對解決我國松材線蟲病具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 外植體材料的獲取

2004年本課題組從日本引進(jìn)了抗松材線蟲病黑松種子［13］，并在句容林場建立了基因庫種子園。抗性黑松未成熟球果采自基因庫種子園，選取抗性較強的30、31、34、35、36、37、39 號家系生長健壯的樹木為母樹，于2012—2013年6月底到8月初每周采集1 次，采集后于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 外植體的處理方法

將抗性黑松未成熟球果(圖1a)的珠鱗剝離后取出種子(圖1b)，放入廣口瓶中用無菌水洗滌干凈，轉(zhuǎn)入滅菌的小三角瓶中，在超凈工作臺上用無菌紗布包好，75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，再用0.1%HgCl2滅菌30 s～3 min，無菌水沖洗3 次后再用無菌濾紙吸去種子表面多余的水分，最后用鑷子剝?nèi)シN殼和內(nèi)種皮，取雌配子體水平放置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種3～5 個雌配子體，用封口膜封住培養(yǎng)皿。對于那些還不能剝掉內(nèi)種皮的幼嫩種子，則連同內(nèi)種皮一起接種。

1.3 球果采集時期對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將各采集時期的雌配子體放入設(shè)計好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基接種3～5 個雌配子體，3 個月后統(tǒng)計胚性、非胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.4 球果冷藏時間對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

采集的抗性黑松球果，分別在冰箱中4 ℃冷藏7、14、21 d，分3 批次接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，3 個月后統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導(dǎo)率以及種子的褐化情況。

1.5 碳源對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將采集的黑松36#家系種子滅菌后接種于分別添加30 g·L-1麥芽糖、蔗糖、葡萄糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每個處理接種雌配子體3～4 個，重復(fù)3 次。暗培養(yǎng)，3 個月左右統(tǒng)計胚性和非胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.6 不同激素對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)的影響

抗性黑松誘導(dǎo)培養(yǎng)基以DCR 為基本培養(yǎng)基［14］，添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.0～4.0 mg·L-1，6-芐氨基嘌呤(6-BA)0～5.0 mg·L-1，6-呋喃甲基腺嘌呤(KT)0～1.0 mg·L-1。每個處理接種雌配子體3～4 個，重復(fù)3 次。暗培養(yǎng)，3 個月左右統(tǒng)計胚性和非胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.7 培養(yǎng)條件和數(shù)據(jù)處理

培養(yǎng)溫度(23±1)℃，暗培養(yǎng)。胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生胚性愈傷組織雌配子體數(shù)/接種雌配子體數(shù))×100%;非胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生非胚性愈傷組織雌配子體數(shù)/接種雌配子體數(shù))×100%，若無特殊說明，上述所有胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均添加30.0 g·L-1麥芽糖，1.0 g·L-1肌醇，450.0 mg·L-1谷氨酰胺(Gln)，500.0 mg·L-1水解酪蛋白(CH)，250.0 mg·L-12-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)，5.2 g·L-1瓊脂粉，高壓滅菌(121 ℃，0.4 MPa)20 min，滅菌前pH 調(diào)至5.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性黑松球果采集期對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

合子胚的發(fā)育階段對成功誘導(dǎo)胚性愈傷組織至關(guān)重要，而球果采集期與合子胚發(fā)育階段關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn):6月20日至7月11日采集的抗性黑松未成熟球果種鱗幼嫩無木質(zhì)化現(xiàn)象;雌配子體呈光亮淺白色(圖1c)，合子胚從雌配子體中抽出多呈透明的絲狀物。6月20日采集的抗性黑松未成熟球果，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率最高(7.8%)。7月11日采集的抗性黑松未成熟球果，胚性愈傷組織的平均誘導(dǎo)率較高(1.5%)。7月18日采集的抗性黑松球果開始出現(xiàn)木質(zhì)化現(xiàn)象，球果顏色逐漸變淡，從深綠轉(zhuǎn)變成黃綠，雌配子顏色呈乳白色，外種皮薄、黃褐色，至此階段平均誘導(dǎo)率(0.4%)開始下降;8月2日胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率為0。胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率與球果采集期呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，即隨著合子胚發(fā)育逐漸成熟，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率逐漸下降。

2.2 抗性黑松球果冷藏時間對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

抗性黑松未成熟球果冷藏時間直接影響雌配子體的質(zhì)量。由表1可見:未成熟球果冷藏7～14 d，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率呈上升趨勢。冷藏時間超過14 d，胚性和非愈傷組織的誘導(dǎo)率下降，并且雌配子體的褐化程度顯著上升?？剐院谒汕蚬洳?～14 d 誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織半透明具黏性(圖1d，e，g)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長速度較快。冷藏14～21 d，雌配子體逐漸變軟顏色發(fā)黃，表面無光澤，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率為0。

表1 冷藏時間對抗性黑松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 碳源對抗性黑松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

糖類作為抗性黑松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的碳源，其種類對胚性愈傷組織的發(fā)生會產(chǎn)生不同的影響(表2)，在麥芽糖和蔗糖為碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上都能產(chǎn)生非胚性愈傷組織，但只有在麥芽糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上獲得抗性黑松胚性愈傷組織。而以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上不能誘導(dǎo)胚性和非胚性愈傷組織的發(fā)生，可見麥芽糖更適合作為抗性黑松體胚發(fā)生的碳源。

表2 不同碳源對抗性黑松愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 植物激素對抗性黑松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

植物激素在誘導(dǎo)胚性愈傷組織的過程中至關(guān)重要，不同的激素配比與組合對胚性愈傷組織的發(fā)生產(chǎn)生不同的作用(表3)。2，4-D 質(zhì)量濃度1 mg·L-1，當(dāng)2，4-D 與KT 質(zhì)量濃度比為2 ∶1 時，抗性黑松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率要明顯高于5 ∶1 配比;2，4-D 質(zhì)量濃度4 mg·L-1，當(dāng)2，4-D 與KT 質(zhì)量濃度比為4 ∶1 和2，4-D 與6-BA 質(zhì)量濃度2 ∶1 時，分別獲得誘導(dǎo)率的最高值(7.5%);保持KT 質(zhì)量濃度0.5 mg·L-1，增加2，4-D 質(zhì)量濃度，抗性黑松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率降低，說明低質(zhì)量濃度的2，4-D更適合抗性黑松胚性愈傷組織的誘導(dǎo);保持2，4-D質(zhì)量濃度4 mg·L-1，KT 質(zhì)量濃度變化對抗性黑松胚性愈傷組織誘導(dǎo)影響顯著，而6-BA 質(zhì)量濃度變化對抗性黑松胚性愈傷組織誘導(dǎo)影響不顯著，需和2，4-D 配合使用才能更好地發(fā)揮作用。誘導(dǎo)抗性黑松胚性愈傷組織最佳激素組合與配比:2，4-D 4 mg·L-1+6-BA 2 mg·L-1或2，4-D 4 mg·L-1+KT 1 mg·L-1。

表3 不同激素配比對抗性黑松愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖1 抗性黑松未成熟合子胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)

3 結(jié)論與討論

植物胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是一個復(fù)雜的過程，一般來說，合子胚比植物幼嫩組織容易誘導(dǎo)胚性愈傷組織，且未成熟合子胚比成熟合子胚容易誘導(dǎo)胚性愈傷組織。針葉樹胚性愈傷組織的誘導(dǎo)一般以未成熟合子胚為外植體［15］。影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)的因素包括:外植體的年齡和生理狀態(tài)、基因型、基本培養(yǎng)基、碳源、溫度、植物激素的種類和濃度等［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，抗性黑松未成熟球果采集期、球果冷藏時間、植物激素配比與組合以及所選擇的碳源都對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)具有重要的影響。

在松屬樹種中，只有處于某一個發(fā)育階段(窗口期)的幼胚才對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)反應(yīng)敏感［17］。比較北美喬松(P.strobus)［18］、海岸松(P.pinaster)、歐洲赤松(P.sylvestris)［2］等幼胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織的球果采種期，發(fā)現(xiàn)處于6月下旬至7月上旬的幼胚為以上松屬樹種誘導(dǎo)胚性愈傷組織的敏感期。本研究發(fā)現(xiàn)，在南京地區(qū)，6月20日至7月11日為誘導(dǎo)抗性黑松胚性愈傷組織的較佳時期，這一結(jié)論與以上松屬樹種誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳采種期基本一致。

Pullman et al.［19］研究發(fā)現(xiàn)外植體接種前進(jìn)行冷處理(2～4 ℃)1 周以上，能夠有效提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。吳麗君［20］研究認(rèn)為球果放在冰箱4 ℃冷藏20 d 內(nèi)有利于濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)，Haggman et al.［21］在研究紅松體胚發(fā)生中有相似的報道。本研究發(fā)現(xiàn)，抗性黑松球果冷藏7～14 d 能有效提高胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率，冷藏超過14 d 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率下降，這與以上結(jié)論基本相符。

目前，針葉樹誘導(dǎo)胚性愈傷組織發(fā)生常用的碳源有蔗糖和麥芽糖。楊模華等［22］利用蔗糖誘導(dǎo)出了馬尾松胚性愈傷組織;馬麗源等［23］利用蔗糖誘導(dǎo)出了油松(P.tabuliformis)胚性愈傷組織;Maruyama et al.［24］利用蔗糖、李清清等［11］利用麥芽糖誘導(dǎo)出黑松未成熟合子胚胚性愈傷組織并能發(fā)育成完整的體胚苗。本研究選用麥芽糖、蔗糖和葡萄糖為碳源，但只有在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出了胚性愈傷組織，說明麥芽糖更適合抗性黑松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。

體胚誘導(dǎo)過程中適當(dāng)?shù)募に嘏浔葘φT導(dǎo)的影響也很關(guān)鍵［25］。韓登媛等［26］在研究華北落葉松(P.larix)胚性愈傷組織誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)2，4-D 是主要影響因子，其次是KT，最后是6-BA，并且2，4-D 不能單獨使用，需要與KT，6-BA 合理配合才能使胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率提高。本研究表明，不同的激素配比與組合對抗性黑松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)作用不同。低質(zhì)量濃度的2，4-D 更適合抗性黑松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，KT 質(zhì)量濃度變化對抗性黑松胚性愈傷組織誘導(dǎo)影響比6-BA 明顯，本試驗得出誘導(dǎo)抗性黑松胚性愈傷組織最佳激素組合為2，4-D 4 mg·L-1+6-BA 2 mg·L-1或2，4-D 4 mg·L-1+KT 1 mg·L-1。

黑松體細(xì)胞胚胎發(fā)生在國內(nèi)外有少量報道，而且胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均較低。Maruyama et al.［24］以日本黑松未成熟合子胚為外植體建立了體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為2%，國內(nèi)李清清等［11］以黑松未成熟合子胚為外植體，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為1.67%。本研究以日本抗松材線蟲病黑松未成熟合子胚為材料，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為7.8%，可為抗性黑松體胚發(fā)生提供基礎(chǔ)材料。

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