付莉 胡春祥

(黔南州林業(yè)種苗站，黔南州，558000) (東北林業(yè)大學(xué))

責(zé)任編輯:程 紅。

舞毒蛾(Lymantria dispar)是一種雜食性食葉害蟲(chóng)，其寄主包括楊、柳、桑、蘋(píng)果、柿、梨、桃和杏等500多種植物，分布于亞洲(日本、中國(guó)、朝鮮)、歐洲和北美洲，在我國(guó)主要分布于東北、華北、西北、華東、華中、華南和西南等地區(qū)［1-2］。

羧酸酯酶(CarE)是酯酶家族中的一種重要水解酶，在有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的抗性形成中起重要作用［3-4］。目前，CarE 的測(cè)定方法雖然已經(jīng)很成熟，但不同來(lái)源的CarE 最適測(cè)定條件存在差異，而舞毒蛾CarE 活性最佳反應(yīng)體系未有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定舞毒蛾CarE 最適反應(yīng)條件，為深入研究舞毒蛾CarE 生物化學(xué)特性以及CarE 介導(dǎo)的殺蟲(chóng)劑抗藥性形成機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

舞毒蛾幼蟲(chóng)采集于東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)內(nèi)，幼蟲(chóng)采用健康無(wú)污染的成年白樺(Betula platyphylla)葉片飼養(yǎng)，每天定時(shí)觀察并更換新鮮樹(shù)葉，將排泄物和食物殘?jiān)皶r(shí)清除。挑取健康、大小一致的3 齡幼蟲(chóng)用于試驗(yàn)。

1.2 主要試劑

固藍(lán)B 鹽、毒扁豆堿、十二烷基硫酸鈉(SDS)購(gòu)自Sigma 公司，α-乙酸萘酯(α-NA)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、牛血清白蛋白均購(gòu)自天津永大化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備

制冰機(jī)(日本SNAYO)、電子天平(美國(guó)奧豪斯Explorer Pro)、微量移液器(上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司)、D-37520 冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sorvall，biofuge stratos)、電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.4 酶液制備

隨機(jī)挑取健康、大小一致的舞毒蛾3 齡幼蟲(chóng)，依照表1中的酶液濃度，用預(yù)冷的不同pH 值的0.04 mol·L-1磷酸緩沖液作為提取液，充分冰浴勻漿后，于4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，取上清液作為原酶液。

1.5 CarE 活性測(cè)定

CarE 活性測(cè)定參照Van Asperen［5］和高希武等［6］的方法，按照正交表L25(56)列出的25 個(gè)處理組合，取0.05 mL 待測(cè)酶液，加入1.8 mL 不同濃度的底物α-乙酸萘酯(含毒扁豆堿1 ∶1)，0.45 mL 不同pH 值的磷酸緩沖液，在恒定溫度下水浴反應(yīng)10、15、20、25、30 min 后加入0.9 mL 顯色劑(V(1%固藍(lán)B 鹽)∶V(5%十二烷基硫酸鈉)=2 ∶5，應(yīng)用前混合而成)終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)在600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度OD 值，通過(guò)α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線求出反應(yīng)生成的α-萘酚的量。

CarE 比活力(μmol·min-1·mg-1)= W/T×P。式中:W 為生成的α-萘酚的量(μmol);T 為反應(yīng)時(shí)間(min);P 為蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)。

1.6 蛋白質(zhì)質(zhì)量測(cè)定

參照Bradford［7］考馬斯亮藍(lán)G-250 方法。

1.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置酶濃度、底物濃度、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間5 個(gè)因素，每個(gè)因素選取5 個(gè)水平，進(jìn)行L25(56)的正交試驗(yàn)，具體組合見(jiàn)表1。

表1 舞毒蛾CarE 最佳反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 舞毒蛾CarE 比活力

不同處理組合間的舞毒蛾CarE 比活力不同，比活力最小的為0.105 7 μmol·min-1·mg-1，最大的為0.418 7 μmol·min-1·mg-1，為最小比活力的3.96 倍(表2)。

表2 不同處理組合下舞毒蛾CarE 比活力

2.2 正交試驗(yàn)極差分析和方差分析結(jié)果

由表3、表4可見(jiàn)，影響舞毒蛾CarE 比活力大小的因子由強(qiáng)到弱依次為酶濃度、pH 值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物濃度，且5 個(gè)因素對(duì)舞毒蛾CarE 比活力影響均極顯著。綜合極差分析和方差分析結(jié)果，5 個(gè)因素對(duì)測(cè)定舞毒蛾CarE 比活力均有顯著影響，因此在測(cè)定時(shí)應(yīng)加以控制。選擇各因素的最優(yōu)水平，可得到測(cè)定舞毒蛾CarE 比活力的最佳條件組合為A1B2C4D5E1，即:酶濃度0.2 頭·mL-1，底物濃度0.2 mmol·L-1，pH=7.5，溫度45 ℃，反應(yīng)時(shí)間10 min。該組合測(cè)定舞毒蛾CarE 比活力體系最佳，CarE 催化能力最強(qiáng)，比活力最大。

表3 正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

有關(guān)CarE 測(cè)定方法的報(bào)道中，來(lái)自不同的物種的CarE 活性測(cè)定最適條件均有不同。柳瓊友等［8］測(cè)定了煙草甲(Lasioderma serricorne)成蟲(chóng)CarE 活性測(cè)定的最適條件為:酶濃度為1 頭·mL-1、底物濃度為0.5 mmol·L-1、pH=7.5、反應(yīng)溫度為42 ℃、反應(yīng)時(shí)間為10 min。魏緒強(qiáng)等［9］測(cè)定德國(guó)小蠊(Blattella germanica)CarE 活性的最佳條件為:酶濃度為0.35只·mL-1、底物濃度為0.6 mmol·L-1、反應(yīng)時(shí)間為5 min、反應(yīng)溫度為40 ℃、pH=6.5。刁青云等［10］測(cè)定了意大利蜜蜂(Apis mellifera)CarE 活性的最佳條件為:酶濃度為每毫升0.3 個(gè)腹部、底物濃度為0.4 mmol·L-1、pH=7.0、反應(yīng)溫度為35 ℃、反應(yīng)時(shí)間為10 min。

本研究結(jié)果表明，舞毒蛾CarE 活性反應(yīng)條件中5 個(gè)因素均對(duì)測(cè)定有顯著的影響，影響舞毒蛾CarE比活力大小的因子由強(qiáng)到弱依次為酶濃度、pH 值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物濃度，最佳反應(yīng)條件組合為:酶濃度0.2 頭·mL-1，底物濃度0.2 mmol·L-1，pH=7.5，反應(yīng)溫度45 ℃，反應(yīng)時(shí)間10 min。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究舞毒蛾羧酸酯酶生化特性奠定基礎(chǔ)。

［1］ 張浩，陳乃中，李正西.中國(guó)舞毒蛾六個(gè)地理種群的RAPD 分析及SCAR 標(biāo)記構(gòu)建［J］.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2011，54(6):714-721.

［2］ 侯雅琴，南楠，李鎮(zhèn)宇.舞毒蛾研究進(jìn)展［J］.河北林果研究，2009，24(4):439-444.

［3］ 吳精晶，牛金志，豆威，等.昆蟲(chóng)羧酸酯酶研究進(jìn)展［C］//公共植保與綠色防控.鶴壁:中國(guó)植物保護(hù)學(xué)會(huì)，2010:370-373.

［4］ 郭晶，高菊芳，唐振華.羧酸酯酶及其在含酯類化合物代謝中的作用［J］.農(nóng)藥，2007，46(6):365-368，381.

［5］ Van Asperen K.A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method［J］.Journal of Insect Physiology，1962，8(4):401-416.

［6］ 高希武，鄭炳宗.幾種農(nóng)藥對(duì)蚜蟲(chóng)羧酸酯酶的抑制和擬除蟲(chóng)菊酯的增效［J］.北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，17(4):89-94.

［7］ Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］.Analytical Biochemistory，1976，72(1/2):248-254.

［8］ 柳瓊友，陳文龍，顧丁，等.正交試驗(yàn)法確定煙草甲成蟲(chóng)羧酸酯酶反應(yīng)的最適條件［J］.西南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，36(3):150-155.

［9］ 魏緒強(qiáng)，錢(qián)坤，曾曉，等.利用正交試驗(yàn)法建立德國(guó)小蠊羧酸酯酶的最佳反應(yīng)體系［J］.中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2008，19(4):294-297.

［10］ 刁青云，姜秋玲，張楠，等.蜜蜂羧酸酯酶最適反應(yīng)條件的測(cè)定方法［C］//2006年全國(guó)蜂產(chǎn)品市場(chǎng)信息交流會(huì)論文集.重慶:中國(guó)養(yǎng)蜂學(xué)會(huì)、中國(guó)蜂產(chǎn)品協(xié)會(huì)，2006:69-72.