黎小平，黃宗海，胡立春，樓彩霞

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院普外科，廣州 510280；2.廣東省佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院普外科，佛山 528244；3.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，佛山 528248)

殼聚糖凝膠對(duì)醋酸誘導(dǎo)大鼠直腸損傷的影響*

黎小平1，2，黃宗海1，胡立春2，樓彩霞3

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院普外科，廣州 510280；2.廣東省佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院普外科，佛山 528244；3.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，佛山 528248)

目的 檢測(cè)殼聚糖凝膠對(duì)醋酸誘導(dǎo)的大鼠直腸損傷的影響。方法 將大鼠麻醉，以4%醋酸棉簽經(jīng)大鼠肛門置入直腸1 min，深度3 cm，制備大鼠直腸損傷模型36只，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組和藥物組，每組12只。藥物組經(jīng)肛門給予殼聚糖凝膠 1 575 mg·kg-1，陽性對(duì)照組給予痔瘡膏1 575 mg·kg-1，連續(xù)6 d，給藥后30 min，1，4，6 d，各組分別處死大鼠3只，解剖大鼠，肉眼觀察大鼠直腸損傷情況，觀察各組之間在給藥各時(shí)間段的直腸病理學(xué)形態(tài)差異。結(jié)果 給藥組用藥30 min，1，4，6 d后，大鼠直腸黏膜損傷計(jì)分較模型對(duì)照組和陽性對(duì)照組低，上皮組織壞死、間質(zhì)充血、出血、水腫、腺體破壞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理現(xiàn)象明顯較模型對(duì)照組和陽性對(duì)照組輕，修復(fù)速度較模型對(duì)照組和陽性對(duì)照組快，并且沒有較明顯的瘢痕出現(xiàn)。結(jié)論 殼聚糖凝膠可明顯減輕4%醋酸造成的直腸損傷，具有一定的治療作用。

殼聚糖凝膠；損傷，直腸；醋酸

痔是常見病和多發(fā)病，可伴有出血、脫垂等癥狀。近年來痔的保守治療取得很大的進(jìn)步，但痔的切除率下降及肛墊保存術(shù)的興起并非意味著傳統(tǒng)的痔切除手術(shù)不重要，特別對(duì)于痔已發(fā)展為Ⅲ度、Ⅳ度，無論是病理解剖，還是生理功能已不再具有可逆性的時(shí)候，手術(shù)治療尤顯得重要[1]。它仍然是目前療效確切的常用方法。臨床上應(yīng)用最多的仍是傳統(tǒng)的外剝內(nèi)扎術(shù)。然而疼痛、出血、感染、肛周水腫及創(chuàng)面延遲愈合等是痔手術(shù)后的常見并發(fā)癥，長(zhǎng)期困擾廣大醫(yī)務(wù)人員。殼聚糖是一種天然高分子聚合物，生物相容性好，毒性低，可生物降解，具有抗菌、止血和成膜作用，廣泛應(yīng)用于生物工程等領(lǐng)域，但目前在痔瘡領(lǐng)域應(yīng)用甚少。筆者在本實(shí)驗(yàn)通過探討殼聚糖凝膠對(duì)醋酸誘導(dǎo)直腸損傷模型的作用[2]，旨在尋找一種藥物減少或減輕術(shù)后并發(fā)癥。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠36只，合格證號(hào)：44007200003906，雄性，體質(zhì)量：180～220 g；由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2008-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物飼養(yǎng)條件：每只大箱飼養(yǎng)6只，飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度：40%～70%，采用10 h：14 h晝夜間斷照明；飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。大鼠自由進(jìn)食飲水，顆粒飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試藥 4%醋酸(廣州中南化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：130113，配制方法：準(zhǔn)確量取醋酸1 mL，加入到純化水24 mL中，混勻。殼聚糖凝膠(沈陽博大精益生物制藥有限公司，批號(hào)：130802，規(guī)格：每支3 g)。陽性對(duì)照痔瘡膏(規(guī)格：每支2.5 g)。

1.3 儀器 TS-12N全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)(孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；BM-VⅡ生物組織包埋機(jī)(孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；RM2135石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；CS-VⅠ攤片烤片機(jī)(孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；RS-18Ⅱ生物組織自動(dòng)染色機(jī)(孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；BX41病理圖像分析系統(tǒng)(日本奧林巴斯)。

1.4 動(dòng)物模型的建立 用飽和苦味酸對(duì)大鼠進(jìn)行編號(hào)，在大鼠體表不同部位的被毛涂染斑點(diǎn)，以示不同號(hào)碼。以大鼠皮膚染色和籠具雙重編號(hào)標(biāo)記識(shí)別。對(duì)購(gòu)入大鼠檢疫3 d。期間每日檢查大鼠一次，未發(fā)現(xiàn)不健康的動(dòng)物，全部納入實(shí)驗(yàn)。造模前，大鼠禁食1 d，將大鼠麻醉，以4%醋酸棉簽經(jīng)大鼠肛門置入直腸1 min，深度3 cm，制備大鼠直腸損傷模型36只。

1.5 大鼠分組和給藥方法 從實(shí)驗(yàn)開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束每天觀察動(dòng)物1次。實(shí)驗(yàn)開始測(cè)量體質(zhì)量1次。將36只大鼠隨機(jī)分為3組：模型對(duì)照組、藥物組和陽性對(duì)照組每組12只。大鼠給藥前，予以麻醉。藥物組在直腸損傷后30 min～6 d，經(jīng)肛門給予殼聚糖凝膠，置入深度為3 cm，給藥劑量為1 575 mg·kg-1[按人的給藥劑量(50 mg·kg-1·d-1)換算，使用大鼠等效劑量的5倍]，每日1次，給藥后按壓大鼠直腸使凝膠融化并分布均勻；陽性對(duì)照組給予痔瘡膏，置入深度為3 cm，給藥劑量為1 575 mg·kg-1，每日1次，給藥后按壓大鼠直腸使藥物分布均勻。模型對(duì)照組給予同樣的按壓，但不給藥物。

1.6 損傷計(jì)分 給藥后30 min和1，4，6 d各個(gè)時(shí)間段，各組分別麻醉處死大鼠3只(共12只)，解剖大鼠，肉眼觀察大鼠直腸損傷情況，參照文獻(xiàn)[2]黏膜損傷計(jì)分方法，記錄黏膜損傷分?jǐn)?shù)：點(diǎn)線狀出血、小紅斑(<1 mm)計(jì)為1分；片狀出血、大紅斑(≥1 mm)計(jì)為3分；糜爛和潰瘍計(jì)為5分。

1.7 病理形態(tài)觀察 所有直腸標(biāo)本常規(guī)脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光鏡觀察并攝像，觀察各組之間、給藥各時(shí)間段的直腸病理學(xué)形態(tài)差異。

2 結(jié)果

2.1 損傷計(jì)分 藥物組給予殼聚糖凝膠30 min，1，4，6 d后，大鼠直腸黏膜損傷計(jì)分較模型對(duì)照組和陽性對(duì)照組低。見表1。

2.2 給藥30 min病理結(jié)果 模型對(duì)照組直腸損傷30 min時(shí)，腸黏膜下出血、水腫和糜爛，鏡下見黏膜上皮組織壞死，部分腺體留存，黏膜下層水腫，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血。陽性對(duì)照組直腸損傷有所減輕，鏡下見黏膜上皮組織壞死，部分腺體留存，黏膜下層水腫，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血；藥物組損傷稍減輕，鏡下見黏膜上皮組織壞死，部分腺體留存，局部黏膜層出血，黏膜下層水腫，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血。見圖1。

2.3 給藥1 d病理結(jié)果 模型對(duì)照組直腸損傷1 d時(shí)，腸黏膜下出血、水腫和糜爛，鏡下見黏膜層全層壞死伴出血，未見腺體留存，黏膜下層水腫、充血、局部出血、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。陽性對(duì)照組直腸損傷減輕，鏡下見黏膜層全層壞死、出血，黏膜下層水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)。藥物組直腸損傷明顯減輕，鏡下見部分黏膜層壞死、出血，黏膜下層水腫、充血、出血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。

表1 3組大鼠給藥不同時(shí)間直腸黏膜損傷計(jì)分

與模型對(duì)照組比較，*1P<0.05；與陽性對(duì)照組比較，*2P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.05；compared with positive control group，*2P<0.05

圖1 3組大鼠直腸損傷造模給藥30 min直腸黏膜損傷和病理圖片(HE，×200)

A.model control group；B.positive control group；C.drug group)

Fig.1 Mucosal injury of rectum and its pathology of three groups of rats 30 min after modeling of rectal injury(HE，×200)

圖2 3組大鼠直腸損傷造模給藥1 d直腸黏膜損傷和病理圖片(HE，×200)

A.model control group；B.positive control group；C.drug group

Fig.2 Mucosal injury of rectum and its pathology of three groups of rats one day after modeling of rectal injury(HE，×200)

2.4 給藥4 d病理結(jié)果 模型對(duì)照組直腸損傷4 d時(shí)，腸黏膜下出血、水腫和糜爛減輕，鏡下見上皮及腺體損傷依然嚴(yán)重，大量黏膜層全層壞死，黏膜下層大量肉芽組織增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)。陽性對(duì)照組直腸損傷稍減輕，鏡下見上皮及腺體損傷稍減輕，黏膜上皮覆蓋不明顯，局部少量黏膜上皮組織脫落。藥物組直腸損傷明顯減輕，鏡下見黏膜上皮覆蓋明顯，局部少量黏膜上皮組織脫落。見圖3。

2.5 給藥6 d病理結(jié)果 模型對(duì)照組直腸損傷6 d時(shí)，腸黏膜下出血、水腫和糜爛減輕，鏡下見上皮及腺體損傷依然嚴(yán)重，部分黏膜上皮組織全層壞死，黏膜下層大量肉芽組織增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)。陽性對(duì)照組直腸損傷大部分痊愈，鏡下見黏膜上皮大部分組織完整，只見少量的壞死、充血、出血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。藥物組直腸損傷基本痊愈，鏡下見黏膜上皮組織完整，未見明顯的壞死、充血、出血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。同時(shí)取正常大鼠(正常對(duì)照組)，處理后取腸黏膜觀察，并作病理切片，各組進(jìn)行比較。見圖4。

圖3 3組大鼠直腸損傷造模給藥4 d直腸黏膜損傷和病理圖片(HE，×200)

A.model control group；B.positive control group；C.drug group

Fig.3 Mucosal injury of rectum and its pathology of three groups of rats four days after modeling of rectal injury(HE，×200)

3 討論

殼聚糖是一種天然高分子聚合物，屬于氨基多糖，學(xué)名：(1.4)-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖。它是少見的帶正電荷的高分子化合物，是至今為止發(fā)現(xiàn)的唯一帶陽離子電荷的堿性多糖[3]，殼聚糖在自然界中廣泛存在于低等生物菌類、藻類的細(xì)胞和節(jié)肢動(dòng)物蝦、蟹、昆蟲等的外殼中。

殼聚糖凝膠(Ⅲ型)是以殼聚糖為主要材料，是一種生物可降解性高分子多糖類生物材料，為芳香、半透明的凝膠，不溶于水，動(dòng)力黏度不低于1 000 mPa·s-1，pH 為4.0～7.0，生物相容性好，毒性低，可生物降解。

殼聚糖對(duì)多種細(xì)菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，是抗菌譜較廣的天然抗菌物質(zhì)，對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及真菌，均有明顯抑制效果[4-6]。其抑菌機(jī)制的最新研究表明：殼聚糖并不是通過干擾細(xì)胞質(zhì)的正常分布而產(chǎn)生作用，而是首先引起細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)酶外泄與細(xì)菌細(xì)胞壁的損壞影響細(xì)胞壁的正常功能，使從而導(dǎo)致菌體的死亡。

殼聚糖有良好的止血效果，雖然目前對(duì)于殼聚糖的止血機(jī)制尚未完全了解，但可以肯定的是其與常規(guī)的依賴血小板和凝血因子的瀑布機(jī)制不同。殼聚糖的止血機(jī)制隨著研究的深入，越來越多的學(xué)者認(rèn)為其止血作用不僅與血小板聚集有關(guān)，更與紅細(xì)胞聚集有關(guān)，紅細(xì)胞膜的負(fù)電荷與殼聚糖的正電荷基團(tuán)間的離子作用力是殼聚糖止血活性的一個(gè)可能的原因。

另外殼聚糖有明顯的膜形成作用，2 min 內(nèi)可以在傷口自然成一層膜，將直腸內(nèi)惡劣的環(huán)境有效隔離，這樣可以保護(hù)創(chuàng)面，明顯減輕創(chuàng)面的疼痛。

近年來，在食品、藥品、保健、生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用日益引起人們的高度重視[7]，但其在痔術(shù)后的應(yīng)用臨床效果國(guó)內(nèi)外報(bào)道目前較少見。

通過本實(shí)驗(yàn)，可看出殼聚糖凝膠可明顯減輕4%醋酸造成的直腸損傷，具有一定的治療作用。但殼聚糖凝膠在臨床上的應(yīng)用及效果還有待于進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)研究。

[1] CERATO M M，PASSOS P，TREIQUE A，et al.Surgical treat-ment of hemorrhoids：a critical appraisal of the current options [J].Arq Bras Cir Diq，2014，27(1)：66-70.

[2] MAYOL L，DE STEFANO D，CAMPANI V，et al.Design and characterization of a chitosan physical gel promoting wound healing in mice [J].J Mater Sci Mater Med，2014，25(6)：1483-1493.

[3] CHEN S C，WU Y C，MI F L，et al.A novel pH-sensitive cydrogel composed ofN，O-carboxymethyl chitosan and alginate cross-linked by genipin for protein drug delivery[J].J Control Release，2004，96(2)：285-300.

[4] FRIEDMAN A J，PHAN J，SCHAIRER D O，et al.Anti-microbial and anti-inflammatory activity of chitosan-alginate nanoparticles：a targeted therapy for cutaneous pathogens [J].Invest Dermatol，2013，133(5)：1231-1239.

[5] HARKINS A L，DURI S，KLOTH L C，et al.Chitosan-cel-lulose composite for wound dressing material.Part 2.Antimicrobial activity，blood absorption ability，and biocompatibility [J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2014，102(6)：1199-1206.

[6] RABEA E I，BADAWY M E I，STEURBAUT W，et al.Invitroassessment ofN-(benzyl)chitosan derivatives against some plant pathogenic bacteria and fungi[J].Eur Polym J，2009，45(3)：237-245.

[7] HUSSEIN-AL-ALI S H，EL ZOWALATY M E，HUSSEIN M Z，et al.Synthesis，characterization，controlled release，and antibacterial studies of a novel streptomycin chitosan magntetic nanoantibiotic [J].Int J Nanomedicine，2014，9(2)：549-557.

DOI 10.3870/yydb.2015.06.008

Effect of Chitosan Gel on the Rectum Injury Induced by Acetic Acid in Rats

LI Xiaoping1,2,HUANG Zonghai1,HU Lichun2,LOU Caixia3

(1.DepartmentofGeneralSurgery,ZhujiangHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510280,China；2.DepartmentofGeneralSurgery,theThirdPeople’sHospitalofNanhaiDistrict,FoshanCity,GuangdongProvince,Foshan528244,China；3.MedicalAnimalExperimentCenterofGuangdongProvince,Foshan528248,China)

Objective To detect the effect of chitosan gel on rectal injury which was induced by acetic acid. Methods 36 rats were anesthetized, 4% acetic acid swab was placed into the rectum (3 cm in depth for 1 min) to establish rectum injury model.These rats were divided into model control group, positive control group and drug group with 12 rats each group randomly.Chitosan gel was given to the drug group through anus with the dose of 1 575 mg·kg-1, and hemorrhoid cream (1 575 mg·kg-1) was administered in the positive control group for 6 successive days.At 30 min, 1, 4, 6 day(s) after administration, 3 rats of each group were sacrificed， and were dissected, rectal injury and rectal pathology morphology changing of each group at different time points of administration were compared through visual observation. Results At 30 min, 1, 4, and 6 day(s) after administrating chitosan gel, score of rectum mucosa injury in dury group was lower than those in model control and positive control group.Pathological changes (including epithelial tissue necrosis, mesenchyme hyperemia, hemorrhage, edema, gland injury, infiltration of inflammatory cells) were significantly slighter in drug group than in model control group and positive control group.Those lesions were restored faster in drug group than in model control group and positive control group, and there was no obvious scar. Conclusion Chitosan gel can obviously alleviate the rectal injury caused by 4% acetic acid and has therapeutic effect.

Chitosan gel；Injury, rectum； Acetic acid

2014-04-02

2014-07-31

*佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目(201308149)

黎小平(1975-)，男，江西南城人，副主任醫(yī)師，在讀博士，研究方向：痔瘡治療的進(jìn)展。電話：(0)18124804355，E-mail：pingli1975@sina.com。

R965；R657.1

A

1004-0781(2015)06-0733-04