廖余平，李曉紅，孫洪濤

綜述

Ts-SV40介導(dǎo)的溫敏細(xì)胞研究現(xiàn)狀

廖余平，李曉紅，孫洪濤△

非永生化細(xì)胞在體外的傳代次數(shù)、增殖活性是有限的，在應(yīng)用于細(xì)胞治療或者是體外研究中會(huì)受到細(xì)胞數(shù)量的限制。轉(zhuǎn)染有ts-SV40LT基因的細(xì)胞在許可溫度下具有最大的增殖活性，在許可溫度進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增能彌補(bǔ)細(xì)胞數(shù)量不足的限制，非許可溫度可用于細(xì)胞治療或研究其生理特性。其研究領(lǐng)域涉及腹膜的間質(zhì)細(xì)胞、泌尿道肌衛(wèi)星細(xì)胞、口腔上皮細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、骨髓血管內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肥大細(xì)胞、足細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞等。本文對(duì)ts-SV40介導(dǎo)的溫敏細(xì)胞的研究現(xiàn)狀做一綜述。

轉(zhuǎn)染；低溫，人工；綜述；ts-SV40；溫敏細(xì)胞；亞低溫；永生化

溫度敏感猿猴病毒大 T抗原（temperature sensitive simian virus 40 large T antigen，ts-SV40LT）在許可溫度下能促進(jìn)細(xì)胞增殖，在非許可溫度則抑制細(xì)胞增殖。在應(yīng)用細(xì)胞移植治療過(guò)程中，轉(zhuǎn)染有ts-SV40LT基因的細(xì)胞在體外許可溫度下進(jìn)行擴(kuò)增以彌補(bǔ)移植細(xì)胞不足的限制，移植到體內(nèi)后在非許可溫度實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或基因治療的作用。本綜述旨在概述ts-SV40LT基因的作用機(jī)制、涉及研究領(lǐng)域及應(yīng)用。

1　研究背景

SV40屬多瘤病毒家族，是20世紀(jì)60年代初由Sweet和Hilleman從猴腎細(xì)胞中分離得到的一種DNA病毒。SV40基因組是一條單拷貝雙鏈、環(huán)狀、超螺旋DNA，由調(diào)控區(qū)、早期編碼區(qū)和晚期編碼區(qū)3個(gè)不同的功能區(qū)組成。早期編碼區(qū)編碼3種蛋白：位于核內(nèi)的LT抗原、小T抗原和17KT。合成的LT抗原蛋白98%定位于細(xì)胞核內(nèi)，是具有ATP酶和DNA解旋酶活性的多功能磷酸蛋白，能夠促進(jìn)宿主細(xì)胞進(jìn)入S期。由于干預(yù)了細(xì)胞周期控制，LT抗原就代表了SV40的主要轉(zhuǎn)化蛋白。

非永生化細(xì)胞體外每經(jīng)過(guò)一次細(xì)胞周期端粒就縮短一次，并逐漸失去分裂能力，趨向凋亡。細(xì)胞永生化是指細(xì)胞獲得持續(xù)生長(zhǎng)增殖能力的特性，永生化細(xì)胞具有無(wú)限增殖生長(zhǎng)的特性，可長(zhǎng)期傳代并多伴有核型改變［1］。端粒酶的激活可使端粒長(zhǎng)度保持相對(duì)穩(wěn)定，從而使細(xì)胞獲得永生化。自然狀態(tài)下嚙齒類動(dòng)物自發(fā)永生化的概率非常小，為1×10-6～1× 10-5，人類細(xì)胞發(fā)生的概率更是小于1×10-12。因此，要使用各種物理和生物因素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生永生化，其中SV40LT抗原是非造血細(xì)胞永生化最常用的成分［1-2］。SV40LT基因感染宿主細(xì)胞并與宿主細(xì)胞DNA穩(wěn)定整合重組后能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SV40LT抗原，加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖速率，同時(shí)也能保留原始細(xì)胞許多分化表型，具有相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，在細(xì)胞水平上可反映原始細(xì)胞的生物學(xué)特性。

2　SV40介導(dǎo)永生化的機(jī)制

雖然SV40是基本的病毒性致癌物質(zhì)，作為永生化的常用基因片段其LT抗原基因也已被確認(rèn)為癌基因，但SV40病毒引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和發(fā)生永生化仍然是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其機(jī)制尚不完全清楚，多認(rèn)為是諸多因素共同參與和調(diào)控的結(jié)果。在諸多的因素中，p53和pRb與SV40LT抗原所介導(dǎo)的永生化最為密切，研究也最多。由393個(gè)氨基酸組成的核磷蛋白基因編碼的p53具有轉(zhuǎn)錄因子作用，野生型p53在細(xì)胞周期G1期停滯時(shí)能檢測(cè)DNA的完整性，并通過(guò)其過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)受損的細(xì)胞凋亡，以確保DNA復(fù)制的完整性，如果p53基因發(fā)生突變，則失去細(xì)胞周期G1檢查點(diǎn)功能［3］。LT抗原可以與p53結(jié)合形成復(fù)合體使p53失活，在對(duì)SV40轉(zhuǎn)化的大鼠細(xì)胞中LT抗原磷酸肽分析以及對(duì)SV40裂解性感染細(xì)胞的分析表明，游離的LT抗原與和p53結(jié)合的LT抗原有不同的磷酸化方式，最顯著的差別就是p53復(fù)合體的LT抗原不含磷酸肽。這些磷酸肽是由小鼠雙微體基因（murine double minute 2，MDM2）衍生來(lái)的，MDM2是p53拮抗劑，可能與p53-LT復(fù)合而形成p53-LT-MDM2三聚體發(fā)生共沉淀。MDM2在SV40轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中與游離p53大量結(jié)合，而游離的LT抗原不與MDM2復(fù)合，提示MDM2蛋白與LT抗原有一個(gè)特殊的靶識(shí)別途徑。這一特殊途徑由于MDM2蛋白在正常細(xì)胞和SV40轉(zhuǎn)化細(xì)胞中顯著不同的磷酸化方式而顯得更突出。另外，與p53一樣，MDM2蛋白在SV40轉(zhuǎn)化細(xì)胞中代謝穩(wěn)定，這提示通過(guò)SV40這一特殊靶識(shí)別途徑的目的在于抑制SV40轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的由MDM2誘導(dǎo)的p53蛋白酶體降解，從而使這些細(xì)胞中p53代謝穩(wěn)定［4］。

3　溫度敏感細(xì)胞的特征

SV40溫度敏感突變體指的是溫度依賴而發(fā)生構(gòu)象改變的LT抗原基因，在許可溫度下能促進(jìn)細(xì)胞增殖，在非許可溫度則抑制細(xì)胞增殖。ts-SV40LT基因包含一個(gè)單核苷酸突變而導(dǎo)致纈氨酸在非許可溫度發(fā)生構(gòu)象改變［5-6］。

野生型SV40LT抗原通過(guò)滅活一些腫瘤抑制因子如p53、pRb等保持細(xì)胞的永生化［7-8］。ts-SV40LT是SV40LT抗原突變等位基因，許多從轉(zhuǎn)導(dǎo)該基因動(dòng)物提取的細(xì)胞系呈現(xiàn)出溫度依賴的生長(zhǎng)特點(diǎn)，在非許可溫度下細(xì)胞分化或生長(zhǎng)停止而出現(xiàn)凋亡［9］。劉洪良等［10］認(rèn)為盡管其細(xì)胞呈現(xiàn)溫度敏感生長(zhǎng)特點(diǎn)，在非許可的39℃LT抗原及S期標(biāo)志物增殖性細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的含量并沒(méi)有明顯下降。細(xì)胞周期分析提示在39℃位于G1前期時(shí)間明顯增加，代表細(xì)胞凋亡標(biāo)志的S期下降，因此認(rèn)為細(xì)胞的永生化及增長(zhǎng)歸因于ts-SV40LT抗原的持續(xù)表達(dá)。

Kim等［11］利用ts-SV40LT抗原溫度敏感性特性讓細(xì)胞在37～39℃條件下培養(yǎng)一段時(shí)間滅活LT抗原，危機(jī)期逃逸細(xì)胞將在幾代內(nèi)逐漸死亡。但仍有約0.053%～0.093%的細(xì)胞能夠進(jìn)入S期，對(duì)溫度不再敏感得以繼續(xù)生存，盡管這些細(xì)胞端粒酶持續(xù)表達(dá)，端粒長(zhǎng)度保持恒定，但染色體損傷不能避免。這就提示使用這些細(xì)胞必須謹(jǐn)慎，因?yàn)槠湓谂R床應(yīng)用時(shí)可能出現(xiàn)不可預(yù)料的表型變化。

Ts-SV40LT在許可的33℃能與p53及pRb形成復(fù)合體促進(jìn)細(xì)胞增殖，但在非許可溫度，ts-SV40LT迅速被滅活并從其復(fù)合物中釋放pRB或p53［12-13］，細(xì)胞停留在G1或G2/M期［14］，劉洪良等［10，15］利用ts-SV40LT的溫度可調(diào)控特性建立一種溫度敏感的干細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞在其適宜溫度（33℃）下大部分處于S期，但當(dāng)其處于37℃環(huán)境中時(shí)多停滯于G1期。這就提示在適宜溫度下細(xì)胞呈現(xiàn)LT抗原促進(jìn)細(xì)胞增殖的特點(diǎn)，在非適宜溫度呈現(xiàn)LT抗原滅活的作用。然而，在非許可溫度細(xì)胞的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。

4　溫敏細(xì)胞目前應(yīng)用

4.1間皮細(xì)胞的腹膜損傷修復(fù)研究隨著腹膜透析的廣泛推廣，由此產(chǎn)生的腹膜損傷發(fā)病率也增高，間葉細(xì)胞移植治療可能是一種有效的治療方法。Kanda等［16］通過(guò)ts-SV40轉(zhuǎn)基因大鼠建立溫敏間葉細(xì)胞系進(jìn)行了誘導(dǎo)間葉細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化的研究，該細(xì)胞系在33℃呈現(xiàn)細(xì)胞增殖活性，于38℃環(huán)境培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞增殖停止并趨向分化，不僅實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞表型的改變，也實(shí)現(xiàn)了成纖維細(xì)胞的生物作用，該研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞自身分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有成纖維化及趨化作用，但間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腹膜損傷的安全性及有效性有待進(jìn)一步評(píng)估，其中就包括腹膜原位移植間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量或次數(shù)探索［5］。

4.2誘導(dǎo)泌尿道括約肌衛(wèi)星細(xì)胞肌源性分化研究前列腺切除術(shù)后尿道括約肌損傷易導(dǎo)致尿失禁。Sumino等［17］研究不同生長(zhǎng)因子對(duì)泌尿道括約肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響。將人肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)ts-SV40LT后于33℃環(huán)境下培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，在39℃誘導(dǎo)其分化。其研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth，HGF）不能誘導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞的肌源性分化，胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）通過(guò)PI3-K途徑誘導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞分化為肌源性細(xì)胞［18］。這些發(fā)現(xiàn)提供了一種可能的新方法，即利用肌衛(wèi)星細(xì)胞用于尿失禁治療。

4.3鼠科口腔上皮細(xì)胞增殖的分化研究上皮組織具有分隔外界環(huán)境，保護(hù)組織不受外界病菌侵入的作用。Tabuchi等［19］通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)有ts-SV40基因胎鼠建立永生化的口腔上皮細(xì)胞系，其細(xì)胞在33℃或中間溫度37℃呈現(xiàn)出細(xì)胞增殖的特點(diǎn)，在非許可的39℃增殖停止并呈現(xiàn)凋亡的跡象。組織學(xué)及免疫組織化學(xué)分析表明細(xì)胞在37℃具有分層上皮樣細(xì)胞形態(tài)改變特點(diǎn)，免疫分析表明其細(xì)胞表達(dá)有口腔上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記的多層鱗狀角化蛋白?？梢灶A(yù)期這個(gè)細(xì)胞系將被用作體外模型研究如上皮細(xì)胞生理學(xué)功能、口腔上皮基因表達(dá)及上皮組織修復(fù)研究。

4.4腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞的分化誘導(dǎo)Murata等［20］利用轉(zhuǎn)染有ts-SV40基因的大鼠建立了一個(gè)腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞系，細(xì)胞在33℃的許可溫度時(shí)在膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)源性生長(zhǎng)因子（glial cell line-derived neurotropic factor，GDNF）等營(yíng)養(yǎng)因子的作用下細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)。非許可的39℃時(shí)在GDNF等營(yíng)養(yǎng)因子的作用下分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。其研究表明，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在溫度變化時(shí)，可將其癌基因滅活，并在GDNF和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的同時(shí)作用下具有終末分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的能力。該細(xì)胞系提供了一個(gè)實(shí)用的可用于神經(jīng)元分化調(diào)節(jié)機(jī)制研究的系統(tǒng)模型。

4.5骨髓血管內(nèi)皮細(xì)胞向血管組織的分化組織內(nèi)皮細(xì)胞移植修復(fù)主要考慮從大血管如臍靜脈分離及培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞。然而，這些細(xì)胞模型的建立尚存在某些限制，例如與預(yù)期壽命相比其增殖潛力有限，在功能表現(xiàn)上具有易變性。Hattori等［21］從ts-SV40轉(zhuǎn)基因鼠骨髓分離單核細(xì)胞后于37℃將其誘導(dǎo)為分化型內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs），接下來(lái)轉(zhuǎn)移到ts-SV40LT許可的33℃培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)RT-PCR可檢測(cè)到VEGF、VEGF受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）、血管性血友病因子（von Willebrand，vWF）的分泌表達(dá)。應(yīng)用ts-SV40轉(zhuǎn)基因大鼠提取的各種細(xì)胞將可能用于檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞與器官或組織的相互作用，并可能通過(guò)這些細(xì)胞作為基因治療的運(yùn)載工具用于抑制或活躍血管原位再生。

4.6應(yīng)用人類胎兒視網(wǎng)膜永生化細(xì)胞治療視網(wǎng)膜疾病人類胎兒的視網(wǎng)膜細(xì)胞被廣泛用于視網(wǎng)膜退行性變的細(xì)胞替代治療，其應(yīng)用的一個(gè)主要缺陷就是缺乏足夠的持續(xù)細(xì)胞來(lái)滿足治療需求。Hasan等［22］利用攜帶有ts-SV40LT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜祖細(xì)胞獲得溫敏視網(wǎng)膜細(xì)胞系，對(duì)該細(xì)胞系于33℃培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，于37℃誘導(dǎo)其分化。為了評(píng)估這些細(xì)胞與病變細(xì)胞的相容性并屏蔽其潛在的致瘤性，將其移植到新生正常鼠及視網(wǎng)膜病變鼠中，兩組的移植細(xì)胞表現(xiàn)出與受體鼠罕見(jiàn)的相容性，但沒(méi)有表達(dá)成熟的分化表型。盡管移植的永生化細(xì)胞呈現(xiàn)出較高的生存率，但其生存時(shí)間不長(zhǎng)，最終所有的移植細(xì)胞都被巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬。這項(xiàng)研究表明，永生化的胎兒視網(wǎng)膜細(xì)胞能保持其祖細(xì)胞的特點(diǎn)，可能作為移植供體細(xì)胞治療視網(wǎng)膜退行性疾病。

4.7應(yīng)用溫敏干細(xì)胞聯(lián)合亞低溫治療急性顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI） 干細(xì)胞移植對(duì)TBI具有潛在的治療作用。然而，TBI后缺氧微環(huán)境以及毒素積累可導(dǎo)致移植細(xì)胞存活率不高，從而限制其臨床應(yīng)用，亞低溫治療具有改善TBI后微環(huán)境的作用。Tu等［23］推測(cè)溫敏干細(xì)胞聯(lián)合亞低溫具有促進(jìn)移植細(xì)胞存活的作用，尤其是在亞低溫下呈現(xiàn)最大活性的溫敏干細(xì)胞，在這項(xiàng)研究中，運(yùn)用質(zhì)粒攜帶ts-SV40基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞用于TBI治療，對(duì)大鼠認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)功能的改善與對(duì)照組相比更加明顯。神經(jīng)干細(xì)胞移植后功能恢復(fù)需要一定的時(shí)間，需要新分化的神經(jīng)元成熟并且與受體整合，但溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元尚需進(jìn)一步研究。

4.8其他肥大細(xì)胞（mast cells，MCs）在體內(nèi)廣泛分布于黏膜組織，在抵抗寄生蟲(chóng)及細(xì)菌侵入時(shí)具有較高的敏感性，甚至可造成過(guò)敏反應(yīng)及自身免疫性疾病。研究MCs的調(diào)控及作用機(jī)制對(duì)治療由MCs異常引起的疾病顯得尤為重要。Kanehira等［24］從轉(zhuǎn)導(dǎo)有ts-SV40大鼠的骨髓提取MCs，研究其在某些刺激因子作用下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)變化特點(diǎn)，促進(jìn)了MCs體外分化及功能研究。Oostendorp等［25］利用ts-SV40轉(zhuǎn)基因大鼠造血基質(zhì)細(xì)胞用于造血因子的表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染有ts-SV40基因的胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)及克隆活性增加。Chittiprol等［26］利用ts-SV40介導(dǎo)永生化足細(xì)胞系研究其在不同條件下基因表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。Herman-Edelstein等［27］利用ts-SV40介導(dǎo)永生化足細(xì)胞用于糖尿病腎病研究，Wang等［28］利用ts-SV40轉(zhuǎn)基因大鼠用于庫(kù)普弗細(xì)胞（Kupffer cell，KC）的體外研究，轉(zhuǎn)染有ts-SV40的KC保持了原始KC的特性，提供了一個(gè)適宜的方法評(píng)估KC在肝損傷以及慢性疾病中的角色。

5　展望

Ts-SV40在許可溫度下能促進(jìn)細(xì)胞增殖，在非許可溫度下則抑制細(xì)胞增殖。利用其在許可溫度促進(jìn)細(xì)胞增殖的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于細(xì)胞移植治療，轉(zhuǎn)染有ts-SV40LT基因的細(xì)胞在體外許可溫度下進(jìn)行擴(kuò)增可以彌補(bǔ)移植細(xì)胞不足的限制，移植到體內(nèi)后在非許可溫度下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或基因治療的作用；在應(yīng)用于非永生化細(xì)胞體外研究中，可通過(guò)轉(zhuǎn)染ts-SV40LT基因于許可溫度進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增、非許可溫度研究其生理特性。其涉及研究領(lǐng)域廣泛，但分子機(jī)制尚不完全明確，多次傳代之后其細(xì)胞分化潛能、形態(tài)學(xué)及功能改變、潛在的致瘤性仍然是其應(yīng)用的主要障礙，其安全性及廣泛應(yīng)用有待進(jìn)一步探索。ts-SV40轉(zhuǎn)染細(xì)胞在33℃有最大的增殖活性，與亞低溫治療的溫度相契合，可能是一個(gè)新興的研究方向。

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（2014-05-23收稿2014-11-13修回）

（本文編輯魏杰）

Research status on Ts-SV40-mediated temperature sensitive cells

LIAO Yuping，LI Xiaohong，SUN Hongtao△
Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology，Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin Key Labrotary of Neurotrauma Repair，Tianjin 300162，China
△Corresponding AuthorE-mail:chenmo333@163.com

The in vitro passage number and proliferation of non-immortalized cells are limited，which restrictions cell therapy or in vitro studies.Cells transfected with temperature sensitive simian virus 40 large T antigen（ts-SV40LT）gene could show the greatest proliferation.The cells can be amplified with compensating the lack of limited number of cells under the permissive temperature.Non-permissive temperature can be used in studying the cell therapy or its other physiological characteristics.This research field involves peritoneal stromal cells，satellite cells of urinary tract，oral epithelial cells，adrenal medullary cells，bone marrow-derived endothelial cells，retinal progenitor cells，mesenchymal stem cells，hematopoietic stem cells，mast cells，podocytes and Kupffer cells.In this study，the current research on Ts-SV40-mediated temperaturesensitive cells was reviewed.

transfection；hypothermia，induced；review；ts-SV40；temperature sensitive cells；hypothermia；immortalization

Q28

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.027

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81471275，81271392，81341113）

天津，腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院，天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300162）

廖余平（1989），男，碩士在讀，主要從事中樞神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)研究

△E-mail:chenmo333@163.com