喬進，竇志華，施忠，吳鋒，孟國梁，陳惠，鄭惠華

(1.江蘇省南通市第三人民醫(yī)院藥劑科，南通 226001；2.南通大學醫(yī)學院藥理學系，南通 226001；3.江蘇安惠生物科技有限公司，南通 226006)

靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍對2型糖尿病模型大鼠氧化應激的影響*

喬進1，竇志華1，施忠1，吳鋒2，孟國梁2，陳惠3，鄭惠華3

(1.江蘇省南通市第三人民醫(yī)院藥劑科，南通 226001；2.南通大學醫(yī)學院藥理學系，南通 226001；3.江蘇安惠生物科技有限公司，南通 226006)

目的 研究靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍對2型糖尿病大鼠氧化應激的影響。方法 采用斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠高脂飲食4周后，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素30 mg·kg-1造模。成模后將大鼠隨機分為模型對照組、靈芝多糖組(給予靈芝多糖600 mg·kg-1)、二甲雙胍組(給予二甲雙胍600 mg·kg-1)及聯(lián)合用藥組(給予靈芝多糖300 mg·kg-1+二甲雙胍300 mg·kg-1)，另設(shè)正常對照組。給藥治療12周末測量大鼠空腹血糖；測定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平。結(jié)果 用藥組空腹血糖水平均低于模型對照組(P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組血糖顯著低于單獨用藥組(P<0.01)。與模型對照組比較，用藥組血清TC、TG水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)，與單獨用藥組比較，聯(lián)合用藥組血清TC、TG水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與模型對照組比較，用藥組血清SOD水平明顯升高(P<0.01)；與單獨用藥組比較，聯(lián)合用藥組血清SOD水平明顯升高(P<0.05)。與模型對照組比較，用藥組血清MDA水平明顯降低(P<0.01)，聯(lián)合用藥組血清MDA較單獨用藥組明顯降低(P<0.05)。與模型對照組比較，用藥組血清CAT、GSH-Px水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，聯(lián)合用藥組血清CAT、GSH-Px水平較單獨用藥組明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 靈芝多糖、二甲雙胍聯(lián)合用藥能夠有效對抗2型糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應激作用，效果優(yōu)于單獨用藥，其機制可能與增強體內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px水平及調(diào)節(jié)血脂障礙有關(guān)。

靈芝多糖；二甲雙胍；糖尿病；氧化應激

糖尿病(DM)是由于胰島素分泌絕對或相對不足而引起的全身糖、脂、蛋白質(zhì)代謝紊亂性疾病，以血糖增高為特點，可導致多臟器、多系統(tǒng)損傷。近年來，其發(fā)病率逐年上升，已成為繼心血管和腫瘤之后威脅人類生命健康的第三大疾病。因此研究和開發(fā)防治糖尿病的藥物日益受到人們的關(guān)注。越來越多的研究表明，實驗性糖尿病的發(fā)病與氧自由基反應增加和抗氧自由基酶類活性降低密切相關(guān)。Brownlee提出的糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一機制學說更是引起了廣泛關(guān)注，其核心是高糖引起線粒體中超氧陰離子生成過多，導致組織細胞發(fā)生氧化應激，最終導致糖尿病的各種并發(fā)癥[1]。目前西藥控制血糖效果良好，但劑量過大易繼發(fā)耐藥和毒副作用等不良后果。靈芝多糖(ganoderma lucidum polyccharide，GLPs)是靈芝中最有效的成分之一，吳鋒等[2]研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能抑制大鼠體內(nèi)氧化應激。二甲雙胍為臨床常用降糖藥之一，具有明顯降糖和改善胰島素抵抗的作用，近年來研究證實其具有對抗氧化應激及防治糖尿病血管并發(fā)癥的作用[3]。它們聯(lián)合應用治療糖尿病具有理論上的優(yōu)點，在降血糖、抑制體內(nèi)氧化應激水平的同時可以減少二甲雙胍的用量，避免西藥的毒副作用及耐藥。聯(lián)合應用這兩種藥其療效是否優(yōu)于單用，筆者尚未見報道。筆者在本實驗觀察靈芝多糖和二甲雙胍聯(lián)用對2型糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應激的影響，初步探討其作用機制，為臨床應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量150～180 g，南通大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2014-0001；實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0031。大鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 試劑 靈芝多糖(江蘇安惠生物科技有限公司，純度74.03%，批號：100601)；二甲雙胍片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號：67100507，規(guī)格：每片0.25 g)。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司，批號：110103)，臨用前用0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液配成濃度為1% STZ溶液。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒，批號：20110312；丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒，批號：20110313，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒，批號：20110411，過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒，批號：20110411，均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 One Touch血糖儀(強生公司)；7170A全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.4 造模與分組 SD大鼠80只，分成正常對照組和造模組。正常對照組10只，給予普通飼料喂養(yǎng)。造模組70只給予高脂飲食(脂肪20%、奶粉5%、蛋黃粉5%、基礎(chǔ)飼料70%)，喂養(yǎng)4周后禁食12～14 h，予STZ 30 mg·kg-1腹腔注射。1周后，空腹血糖值≥11.1 mmol·L-1即造模成功，繼續(xù)高脂飲食。取40只成模大鼠隨機分為4組：模型對照組，靈芝多糖組，二甲雙胍組，聯(lián)合用藥組，每組10只。靈芝多糖組給予靈芝多糖600 mg·kg-1；二甲雙胍組給予二甲雙胍600 mg·kg-1；聯(lián)合用藥組給予靈芝多糖300 mg·kg-1，二甲雙胍300 mg·kg-1。靈芝多糖溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na)溶液中，二甲雙胍溶解于純凈水。每日上午11：00時灌胃給藥一次，正常對照組和模型對照組予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續(xù)給藥12周。

1.5 血糖測定 給藥前及給藥12周末，禁食14～16 h后，經(jīng)尾靜脈取血，血糖儀測空腹血糖。

1.6 血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)測定 尾靜脈取血，2 000 r·min-1離心15min，分離血清，測定血清TC、TG含量。

1.7 血清SOD、MDA、CAT、GSH-Px水平測定 均按試劑盒說明書上操作要求進行測定。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 正常對照組大鼠外觀狀態(tài)良好，行動自如。模型對照組大鼠一般情況差，飲水量、飲食量、尿量明顯增多，體型消瘦，皮毛雜亂無光澤，表現(xiàn)出典型的三多一少癥狀，實驗過程中死亡大鼠5只，其中模型對照組死亡3只，二甲雙胍組死亡2只。靈芝多糖和二甲雙胍均能減輕大鼠的糖尿病癥狀，但聯(lián)合用藥組較單獨用藥組外觀改善更為明顯。

2.2 空腹血糖 實驗前，3組用藥組血糖與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，模型對照組空腹血糖水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。實驗后，3組用藥組空腹血糖水平均低于模型對照組(P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組血糖顯著低于單獨用藥組(P<0.01)。見表1。

表1 5組大鼠實驗前后空腹血糖水平比較

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01；與單獨用藥組比較，*3P<0.01

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01；compared with single medication group，*3P<0.01

2.3 大鼠血清TC和TG水平 與正常對照組比較，模型對照組血清TC、TG水平明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，用藥組血清TC、TG水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)；與單獨用藥組比較，聯(lián)合用藥組血清TC、TG水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 5組大鼠血清TC和TG檢測值比較

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01；與單獨用藥組比較，*4P<0.01，*5P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01；compared with single medication group，*4P<0.01，*5P<0.05

2.4 大鼠血清SOD和MDA水平 與正常對照組比較，模型對照組血清SOD水平明顯降低(P<0.01)；與模型對照組比較，用藥組血清SOD水平明顯升高(P<0.01)；與單獨用藥組比較，聯(lián)合用藥組血清SOD水平明顯升高(P<0.05)。與正常對照組比較，模型對照組血清MDA水平明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，用藥組血清MDA水平明顯降低(P<0.01)，聯(lián)合用藥組血清MDA較單獨用藥組明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠血清SOD和MDA檢測值比較

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01；與單獨用藥組比較，*3P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01；compared with single medication group，*3P<0.05

2.5 大鼠血清CAT和GSH-Px水平 與正常對照組比較，模型對照組血清CAT、GSH-Px水平明顯降低(P<0.01)；與模型對照組比較，用藥組血清CAT、GSH-Px水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，聯(lián)合用藥組血清CAT、GSH-Px水平較單獨用藥組明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠血清CAT和GSH-Px檢測值比較

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01；與單獨用藥組比較，*4P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01；compared with single medication group，*4P<0.05

3 討論

近年來基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，過氧化物生成增多或抗氧化物質(zhì)不足與糖尿病并發(fā)癥有密切關(guān)系[4]。且有研究證實氧化應激是糖尿病慢性并發(fā)癥的主要發(fā)病機制之一[5]。氧化應激是指機體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失去平衡，或外源性氧化劑的過量攝入導致活性氧在體內(nèi)堆積引起細胞毒性[6]。

干預氧化應激既可從病因上著手，如恢復血糖、血脂的水平；也可從病理的中間環(huán)節(jié)著手，如切斷氧化應激的發(fā)生、消除氧化應激產(chǎn)物等。MDA是不飽和脂肪酸氧化的終產(chǎn)物，其含量的高低可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度。因此，測定MDA水平可間接反映細胞受氧化損傷程度，是反映氧化應激較好的指標[7]。同時氧化應激的發(fā)生和發(fā)展與血清中TC、TG水平有關(guān)[8]。高糖、高脂均可刺激產(chǎn)生過氧化產(chǎn)物，過氧化產(chǎn)物損傷血管內(nèi)皮細胞是糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機制中的關(guān)鍵起步[9]。本實驗中，模型對照組大鼠血清MDA、TC、TG含量顯著升高，3組治療組血清MDA、TC、TG含量顯著下降，且聯(lián)合用藥組比單獨給藥組下降更明顯。SOD、CAT、GSH-Px是體內(nèi)有效的自由基清除劑，它們的催化活性對維持氧化平衡系統(tǒng)非常重要[10]。在體內(nèi)高糖環(huán)境下，機體一方面清除氧自由基的酶(SOD、CAT，GSH-Px)活性降低，另一方面體內(nèi)的氧化應激作用增強，造成大量活性氧自由基在體內(nèi)的積聚，導致活性氧連鎖反應，從而促進糖尿病一系列并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[11]。本研究中，模型對照組大鼠胸主動脈SOD、CAT和GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)。聯(lián)合用藥組的CAT和GSH-Px活性顯著升高(P<0.01)，效果優(yōu)于單獨用藥組(P<0.05)，提示在總劑量不變的前提下，靈芝多糖和二甲雙胍聯(lián)合使用能減少TC、TG和MDA含量，降低血脂水平，抑制體內(nèi)氧化應激的形成，較單獨用藥組能更好增強機體抗氧化能力。

本實驗在2型糖尿病大鼠模型中，靈芝多糖和二甲雙胍通過降低血清中TC、TG含量，增強體內(nèi)清除氧自由基酶的含量來減輕體內(nèi)氧化應激的形成。聯(lián)合應用靈芝多糖和二甲雙胍在對抗糖尿病機體氧化應激的效果方面明顯優(yōu)于單用。在總劑量不變的情況下聯(lián)合兩種藥物可以減少其中一種藥物的劑量。本研究中聯(lián)合用藥減少二甲雙胍的劑量，同時也降低二甲雙胍對降血糖可能帶來的不良反應，并降低大鼠的死亡率。聯(lián)合使用靈芝多糖和二甲雙胍可能會成為今后臨床治療糖尿病及其并發(fā)癥的一個新方向。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.004

Effect of Ganoderma Lucidum Polysaccharides Combined with Metformin on Oxidative Stress of Type 2 Diabetic RatsinVivo

QIAO Jin1，DOU Zhihua1，SHI Zhong1，WU Feng2，MENG Guoliang2，CHEN Hui3，ZHEN Huihua3

(1.DepartmentofPharmacy，theThirdPeople’sHospitalofNantongCity,Nantong226001,China； 2.DepartmentofPharmacology,MedicalCollege,NantongUniversity，Nantong226001,China； 3.JiangsuAnhuiBiologicalTechnologyCo.Ltd,Nantong226006,China)

Objective To study the effect of ganoderma lucidum polysaccharides combined with metformin on oxidative stress of type 2 diabetic rats. Methods SD rats were fed with high fat diet for 4 weeks and injected with streptozotocin (30 mg·kg-1) to produce type 2 diabetic model.The diabetic rats were randomly divided into diabetes model group, ganoderma lucidum polysaccharides group (600 mg·kg-1), metformin group (600 mg·kg-1), combination group (ganoderma lucidum polysaccharides 300 mg·kg-1+ metformin 300 mg·kg-1), After 12 weeks of treatment, the level of fasting blood glucose was determined, and the activity of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px), total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) were detected. Results The levels of fasting blood glucose in the treatment groups were significantly lower than that in the diabetes model group (P<0.01).Furthermore, fasting blood glucose in the combination group was significantly lower than that in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.01).Compared with diabetes model group, serum TC and TG in the treatment groups were significantly lower (P<0.05,P<0.01).Serum TC and TG were significantly lower in the combination group than in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.05,P<0.01).Compared with diabetes model group, serum SOD levels in the treatment groups were significantly higher (P<0.01).Compared with ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group, serum SOD levels in the combination group was significantly higher (P<0.05).Compared with diabetes group, serum MDA levels in the treatment groups were significantly lower (P<0.01).Serum MDA in the combination group was significantly lower than that in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.05).Compared with diabetes model group, serum CAT and GSH-Px in the treatment groups were significantly higher (P<0.05,P<0.01).Serum CAT and GSH-Px in the combination group were significantly higher than those in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.05). Conclusion Ganoderma lucidum polysaccharides combined with metformin could effectively inhibit oxidantion stress in type 2 diabetic rats.The effect was better than ganoderma lucidum polysaccharides or metformin used alone.The possible mechanism may be related to increased activity of SOD, CAT, GSH-Pxinvivoand regulation of dyslipidemia.

Ganoderma lucidum polyccharide； Metformin； Diabetes mellitus； Oxidative stress

2014-05-08

2014-08-05

*科技部十一五國家科技支撐計劃子課題項目(2006DAI06A20-02)；江蘇省優(yōu)勢學科項目

喬進(1985-)，男，江蘇揚州人，主管藥師，碩士，主要從事心血管藥理及臨床藥理研究。電話：(0)13901485175，E-mail：felix_jo@163.com。

竇志華(1966-)，男，江蘇南通人，主任中藥師，碩士生導師，博士，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新中藥研究。電話：0513-85116078，E-mail：zhihuadou@163.com。

R977.15；R965；R589

A

1004-0781(2015)06-0718-04