李德奎，劉 躍，朱清紅，朱名安

(湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000)

小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)及臨床價(jià)值

李德奎，劉 躍，朱清紅，朱名安

(湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000)

目的探討小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)及臨床價(jià)值。方法選取小細(xì)胞肺癌患者67例為觀察組，同期健康體檢人員67例為對照組，均行外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測,比較2組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)情況，分析外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞與臨床特征、腫瘤標(biāo)記物的關(guān)系。結(jié)果觀察組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)率明顯高于對照組，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯多于對照組?；颊唧w力狀況(PS)評分越高，病理分期越高，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移例數(shù)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)越多，神經(jīng)元特異性烯醇化酶水平越高。乳酸鹽脫氫酶越高時(shí)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)率越高。結(jié)論小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)率顯著升高。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的升高幅度與PS評分、病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)以及神經(jīng)元特異性烯醇化酶和乳酸鹽脫氫酶水平有關(guān)。

小細(xì)胞性肺癌；外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞

肺癌是臨床較為常見的腫瘤疾病，近年其發(fā)病率持續(xù)走高[1]，嚴(yán)重威脅著公眾的身體健康。小細(xì)胞肺癌是肺癌的常見類型，屬于未分化癌，占全部肺癌的10%～25%[2]，具有分化程度低、惡性程度高、生長速度快、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，患者5年生存率往往低于10%[3]，預(yù)后較差。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的常見病因[4]。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞是指進(jìn)入人體外周血的腫瘤細(xì)胞，常存在于實(shí)體瘤中，與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等情況關(guān)系密切[5]。為了探討小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)及臨床價(jià)值，本院選取67例小細(xì)胞肺癌患者與67例健康體檢人員行外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測，現(xiàn)將結(jié)果分析如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取本院2010年10月—2013年12月診治的小細(xì)胞肺癌患者67例作為觀察組，均經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查、病理組織學(xué)檢查確診，排除患有其他器質(zhì)性疾病、血液性疾病、免疫性疾病、感染性疾病、精神疾病者；男39例，女28例；年齡37～75(62.7±7.5)歲；體質(zhì)量40～69(53.7±8.1)kg。選擇同期健康體檢人員67例為對照組，男40例，女27例;年齡36～76(62.1±8.4)歲；體質(zhì)量41～70(53.1±9.2)kg。2組年齡、體質(zhì)量、性別等比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究已取得被檢人員同意，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。

1.2方法 2組均行外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測。實(shí)施消毒后，使用真空采血針采集被檢人員的肘正中靜脈血，棄掉穿刺后2 mL，取此后的7.5 mL，加入到EDTA抗凝管中，24 h內(nèi)富集腫瘤細(xì)胞。將血樣復(fù)溫后，于等量PBS緩沖液混勻，沿著貼壁的方向緩緩加入淋巴細(xì)胞分離液，在室溫下離心，轉(zhuǎn)速2 000 r/min，離心20 min，取環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層，加入至5 mL PBS緩沖液中，重復(fù)洗滌2次，在室溫下再次離心，轉(zhuǎn)速2 000 r/min，離心15 min，將細(xì)胞沉淀重懸于80 μL磁珠緩沖液中，然后加入抗CD45抗體20 μL，輕輕敲打混勻后，放置于4 ℃冰箱中孵育15 min，加入磁珠緩沖液2 mL，在室溫下實(shí)施離心，轉(zhuǎn)速2 000 r/min，離心10 min，棄上清，加入PBS緩沖液500 μL重懸細(xì)胞，讓細(xì)胞重懸液過磁珠MS分流柱，然后加入磁珠緩沖液500 μL洗滌，過MS分流柱2次，收集流出的液體，在室溫下離心，轉(zhuǎn)速2 000 r/min，離心10 min，棄上清，將沉淀均勻涂于防脫載玻片上，在室溫下風(fēng)干，使用4%多聚甲醛固定10 min，使用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，在室溫下風(fēng)干。取出切片，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，使用PBS緩沖液浸洗3次，每次5 min，加入Pan-CK，在4 ℃冰箱中過夜。使用PBS緩沖液浸洗3次，每次5 min，加入二抗，在37 ℃溫箱中孵育20 min，使用PBS緩沖液浸洗3次，每次5 min，使用DAB溶液染色，再使用蘇木精復(fù)染3～5 min，使用酸酒精分化、脫水、透明，使用中性樹膠封片即可。

1.3觀察指標(biāo) 觀察2組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)情況,分析觀察組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)情況與年齡、性別、吸煙、家族史、組織學(xué)類型、分化程度、體力狀況(PS)評分、病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)、癌胚抗原、細(xì)胞白蛋白19片段、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、乳酸鹽脫氫酶等的相關(guān)性。

1.4外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的評定標(biāo)準(zhǔn)[6]形態(tài)學(xué)檢查時(shí)，細(xì)胞為圓形、長形或橢圓形，且長徑大于10 μm，在光鏡下可見完整的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核良好。光鏡學(xué)評價(jià)時(shí)，要有完整的細(xì)胞膜，實(shí)施Pan-CK染色為陽性，其胞漿為褐色或藍(lán)黑色，細(xì)胞長徑大于10 μm，核漿比失常。由2位經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員進(jìn)行鏡檢評定。

2 結(jié) 果

2.12組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)情況比較 觀察組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)率明顯高于對照組(P<0.05)，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯多于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2觀察組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 觀察組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)率與年齡、性別、吸煙、家族史、組織學(xué)類型、分化程度無明顯相關(guān)性(P均>0.05)，與PS評分、病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)有顯著相關(guān)性(P均<0.05)。見表2。

表1 2組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)情況

表2 觀察組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.3觀察組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)率與腫瘤標(biāo)記物的關(guān)系 觀察組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)率與癌胚抗原、細(xì)胞白蛋白19片段無明顯相關(guān)性(P均>0.05)，與神經(jīng)元特異性烯醇化酶、乳酸鹽脫氫酶有顯著相關(guān)性(P均<0.05)。見表3。

2.4外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)的多因素回歸分析 PS評分、病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、乳酸鹽脫氫酶均是外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)的影響因素。見表4。

3 討 論

表3 觀察組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)與腫瘤標(biāo)記物的關(guān)系

表4 外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)的多因素回歸分析

隨著人口老齡化的發(fā)展和生活環(huán)境的改變，肺癌的發(fā)病率持續(xù)走高，嚴(yán)重威脅著公眾的身體健康，而老年人也成了肺癌的高發(fā)人群[7]。目前，肺癌的發(fā)病率和死亡率已居世界首位[8]，而小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率也顯著增加。小細(xì)胞肺癌在肺癌中所占的比例為20%～25%，屬于未分化癌，具有分化程度低、惡性程度高、生長速度快，易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。由于患者早期就可發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，對放化療敏感，因而治療應(yīng)以全身化療為主[9]，然而患者的病死率仍然很高。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因，血液傳播是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑。絕大多數(shù)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞可通過機(jī)體免疫系統(tǒng)遭到破壞，僅有極少的腫瘤細(xì)胞可以形成轉(zhuǎn)移病灶[10]。通常把進(jìn)入人體外周血的腫瘤細(xì)胞稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞，對腫瘤患者的預(yù)后和治療方案的選擇具有重要的指導(dǎo)性意義。分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法有多種，包括芯片技術(shù)、依賴流式細(xì)胞技術(shù)、分層技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)等。本研究選用了免疫熒光和免疫磁珠相結(jié)合的方法，該技術(shù)具有高度的敏感性，可有效分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞，還可保留分離細(xì)胞的生物學(xué)活性，便于開展進(jìn)一步研究。被檢人員只需抽取少量外周血就可完成檢測，不會(huì)對機(jī)體造成明顯的損傷，更易為被檢人員所接受。

本研究結(jié)果表明，小細(xì)胞肺癌患者的外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞顯著增加，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)率也顯著升高，說明體內(nèi)發(fā)生了不同程度的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，可用于評定患者的病情，具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞與年齡、性別、吸煙、家族史、組織學(xué)類型、分化程度、癌胚抗原、細(xì)胞白蛋白19片段無明顯相關(guān)性，而與PS評分、病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、乳酸鹽脫氫酶有相關(guān)性，說明PS評分、病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、乳酸鹽脫氫酶均是外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的影響因素。

PS評分是體力狀況評分，能夠反映腫瘤患者的生存質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示，PS評分越高，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)越多，轉(zhuǎn)移的概率越大，陽性表達(dá)率越高。且隨著TNM分期的增加，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)也呈現(xiàn)出明顯的增加趨勢，這也可能是決定腫瘤性質(zhì)的因素之一。發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，機(jī)體血液中已經(jīng)存在了循環(huán)腫瘤細(xì)胞，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)越大，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)越多，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)越多，陽性表達(dá)率越高。神經(jīng)元特異性烯醇化酶與乳酸鹽脫氫酶均是較為常見的腫瘤標(biāo)記物，其中神經(jīng)元特異性烯醇化酶與外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)水平密切相關(guān)[6]，高濃度組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)率明顯高于低濃度組。而乳酸鹽脫氫酶是臨床常見的一種糖酵解酶，邢桂芝等[11]研究表明，血清乳酸鹽脫氫酶能夠隨著肺癌患者病情的進(jìn)展呈現(xiàn)出明顯的升高態(tài)勢。這與本研究的結(jié)果一致，即乳酸鹽脫氫酶的濃度越高，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)越多，陽性表達(dá)率越高。

綜上所述，小細(xì)胞性肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)率顯著升高。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的升高幅度與PS評分、病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、乳酸鹽脫氫酶顯著相關(guān)。

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10.3969/j.issn.1008-8849.2015.33.034

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2015-01-20