陳 杰,陶根魚

(1. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000)

醒腦丸對血管性癡呆大鼠腦組織谷氨酸及乳酸含量的影響

陳 杰1,陶根魚2

(1. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000)

目的研究醒腦丸對血管性癡呆(VD)大鼠腦組織中乳酸(LD)、谷氨酸(Glu)含量的影響。方法先將60只SD大鼠隨機分為正常組8只和造模組52只，造模組采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(2-VO)法制作VD模型，然后將造模成功VD大鼠隨機分為模型組、腦復(fù)康組、醒腦丸低劑量組、醒腦丸中劑量組、醒腦丸高劑量組。造模35d后，腦復(fù)康組開始給予腦復(fù)康84mg/kg灌胃，醒腦丸低、中、高劑量組分別給予醒腦丸水溶液0.21g/kg、0.42g/kg、0.84g/kg灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，均每天1次，持續(xù)14d；末次灌胃后當(dāng)天進行大鼠行為實驗，采用比色法測定大鼠腦組織中LD、Glu含量。結(jié)果模型組大鼠學(xué)習(xí)能力明顯低于正常組(P<0.05)，各給藥組大鼠的學(xué)習(xí)能力明顯高于模型組(P均<0.05)。模型組大鼠腦組織中LD、Glu含量均明顯高于正常組(P均<0.05)，各給藥組大鼠腦組織中LD、Glu含量明顯低于模型組(P均<0.05)。結(jié)論醒腦丸能夠改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用可能是通過降低腦組織中Glu及LD含量實現(xiàn)的。

血管性癡呆；大鼠；醒腦丸；谷氨酸；乳酸

血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是指一組由缺血性和/或出血性腦血管疾病引起的腦功能損害所致的癡呆，好發(fā)于老年人群，多見于中風(fēng)之后。目前認(rèn)為，腦創(chuàng)傷病理過程中存在大量的谷氨酸(Glutamate,Glu)釋放，Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮性遞質(zhì)，參與感光信息處理、協(xié)調(diào)運動、認(rèn)知活動等過程，在缺血情況下，其濃度急劇升高，引發(fā)鈣超載、凋亡及氧自由基損傷等，使蛋白激酶、磷酸酶、鈣蛋白酶等代謝紊亂，導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元壞死[1]。而細胞缺氧、缺血后能量消耗，ATP 的產(chǎn)生減少，無糖酵解增加，產(chǎn)生大量的乳酸(LD)，組織乳酸酸中毒可導(dǎo)致不可逆性神經(jīng)損傷[2]。醒腦丸由黃芪、當(dāng)歸、水蛭、三七、菖蒲、何首烏等十余種藥材精制而成，具有益氣活血、醒腦開竅的作用，臨床用于治療VD取得了較好效果。為探討該藥治療VD的作用機制，筆者觀察了醒腦丸對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織中LD、Glu含量的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗資料

1.1實驗動物 一級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量150～160 g，醫(yī)動字第08-005號，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2主要藥品與試劑 醒腦丸，由陜西中醫(yī)學(xué)院制藥廠制備；吡拉西坦片(腦復(fù)康片)，濟南利民制藥有限責(zé)任公司，批號：060203； 注射用青霉素鈉，哈藥集團制藥總廠，批號：A05108108；紅霉素軟膏，蕪湖三益制藥有限公司，批號：060201；生理鹽水，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，批號：051005122；10%水合氯醛，陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心；Glu試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；LD試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.3模型的建立及分組給藥 SD大鼠正常適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機分為正常組8只與造模組52只。第4天開始讓大鼠進行游泳，以熟悉水迷宮環(huán)境，連續(xù)3 d。第7天采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(2-VO)法[3]建立慢性腦灌注不足VD動物模型：手術(shù)前12 h禁食，術(shù)前4 h禁水。采用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉，確保大鼠能夠自主呼吸。待大鼠翻正反射消失后，將其仰臥固定于手術(shù)臺上，頸前部去毛，從腹側(cè)頸正中劃開，鈍性分離大鼠的皮下脂肪、胸鎖乳頭肌及胸骨舌骨肌等，顯露大鼠的頸動脈，以“0”號絲線雙重結(jié)扎，隨后縫合肌肉、皮膚。手術(shù)結(jié)束后將大鼠放置于通風(fēng)良好的動物房進行飼養(yǎng)，傷口涂抹紅霉素與青霉素預(yù)防感染。造模完成的第31天，讓存活大鼠持續(xù)游泳5 d，進行水迷宮試驗，以正常組大鼠隱匿平臺逃避潛伏期(EL)的平均值作為參考值，計算結(jié)扎大鼠EL平均值與參考值之差占該鼠EL的比值，比值>20%判斷為癡呆鼠造模成功[4]。然后將造模成功大鼠隨機分成模型組9只、腦復(fù)康組8只、醒腦丸低劑量組9只、醒腦丸中劑量組9只、醒腦丸高劑量組9只，腦復(fù)康組給予腦復(fù)康溶液84 mg/kg灌胃，醒腦丸低、中、高劑量組分別給予醒腦丸水溶液0.21 g/kg、0.42 g/kg、0.84 g/kg灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，均每天1次，3 mL/次，持續(xù)14 d。

1.4觀測指標(biāo)

1.4.1大鼠機體狀態(tài) 主要觀察大鼠活動頻繁度、反應(yīng)能力、飲食量等。

1.4.2大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 末次灌胃后，通過Morris水迷宮[5]檢測大鼠的學(xué)習(xí)能力。迷宮配置內(nèi)徑1.5 m、高0.5 m的圓槽，其中含有對應(yīng)的玻璃平臺，能夠讓動物實現(xiàn)攀爬。然后向圓槽中加水至30 cm深，溫度控制在(25±2)℃，并將玻璃平臺放置到某一象限中部水面下1 cm處，其中設(shè)有多個門窗等可以幫助大鼠判斷位置。然后將大鼠放置到平臺中30 s以適應(yīng)環(huán)境，讓大鼠于固定點處入水；計數(shù)大鼠從入水到登上平臺的全部時間即EL及游泳總路程。

1.4.3大鼠腦組織LD、Glu含量 水迷宮試驗后，每組隨機挑選8只脫臼處死，迅速取出腦組織，稱質(zhì)量后以1 g腦組織加入10 mL生理鹽水的比例進行勻漿，3 000 r/min離心10 min后采集上清液并存儲于-20 ℃冰箱中。用化學(xué)比色法測定腦組織中Glu及LD的含量，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進行測定。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠機體狀態(tài) 手術(shù)造模前大鼠基本上都能夠正常飲食與活動，手術(shù)完成后，大鼠均出現(xiàn)飲食減少、活動頻率降低的表現(xiàn)；灌胃過程中模型組死亡1只。灌胃14d后，各給藥組大鼠的上述表現(xiàn)均有所緩解，而模型組大鼠沒有任何改變。

2.2各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 模型組大鼠EL和游泳總路程均明顯高于正常組(P均<0.05)，各給藥組EL和游泳總路程均明顯低于模型組(P均<0.05)，且腦復(fù)康組、醒腦丸中劑量組、醒腦丸高劑量組均低于醒腦丸低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

注:①與正常組比較，P<0.05;②與模型組比較，P<0.05；③與醒腦丸低劑量組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠腦組織中Glu和LD含量比較 模型組大鼠腦組織中Glu、LD含量均明顯高于正常組(P均<0.05)；各給藥組Glu、LD含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且腦復(fù)康組、醒腦丸中劑量組、醒腦丸高劑量組含量均低于醒腦丸低劑量組(P均<0.05)。 見表2。

表2 各組大鼠腦組織中Glu和LD含量比較

注:①與正常組比較，P<0.05;②與模型組比較，P<0.05；③與醒腦丸低劑量組比較，P<0.05。

3 討 論

VD是癡呆類型中唯一可以預(yù)防與治療的疾病，但目前尚無特效治療藥物。該病多由腦血管病變引起，與年齡、種族、動脈硬化等因素有關(guān)[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血和缺血后再灌注能引起腦能量耗竭，興奮性氨基酸(EAA)釋放增加，產(chǎn)生大量自由基，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細胞腫脹、凋亡和壞死等[7]。興奮性氨基酸包括Glu和天門冬氨酸，其中Glu是腦內(nèi)正常的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在介導(dǎo)突觸興奮性活動和突觸可塑性等方面起著重要的作用，同時其也是一種潛在的神經(jīng)毒性物質(zhì)，可直接導(dǎo)致神經(jīng)元壞死及凋亡。Glu系統(tǒng)和學(xué)習(xí)記憶有關(guān),阻斷Glu受體能夠?qū)ι窠?jīng)元起到保護作用[8]。LD在腦組織中的富集主要是由腦缺血造成的，腦組織內(nèi)酸性增高，會損傷正常的神經(jīng)元，并且可能加速自由基的產(chǎn)生、加快脂質(zhì)過氧化過程，最終對腦細胞造成不可逆的損傷[9-10]，盡快清除腦組織中過多的LD有助于保護腦細胞。

VD屬于中醫(yī)“癡呆”“健忘”“癲狂”等范疇，其病位雖在腦，但涉及肝、腎、心、脾，為本虛標(biāo)實證。VD多發(fā)生于40 歲以上之人，而中年以后五臟之氣漸衰，功能低下，臟氣不足則陰精不生,營血不化，陰血不布，使腦乏清陽之助、津血之濡，腦髓失養(yǎng)，神明失用，日久則精髓逐漸枯萎，不能支配全身的運動和感覺，出現(xiàn)健忘、語言顛倒、行為古怪、失認(rèn)失算、麻木不仁等癡呆癥狀，故氣血虧虛是VD的病理基礎(chǔ)。而氣與血生理上密切聯(lián)系，若氣虛無力推動血液運行，必然導(dǎo)致瘀血阻絡(luò)，故瘀阻腦絡(luò)是VD的發(fā)病關(guān)鍵。此外，腦正常功能的維持離不開機體的分清別濁功能，同時必須保證無瘀血阻滯腦絡(luò)，保證腦髓得到充足的血液和氧氣供應(yīng)，因此該病治療關(guān)鍵是益氣活血、醒腦開竅。醒腦丸即基于上述理論所制，方中黃芪具有較強的補氣作用，使氣旺以促血行，從而消除瘀血，且其可提高腦對缺氧耐受力，降低腦組織耗氧量[11]；西洋參同人參功效類似，有較好的補氣功能，但不會損傷陰氣，且其活性成分人參皂苷Rg2可增強大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力[12]；當(dāng)歸活血養(yǎng)血，能有效祛除瘀血；川芎作為血中之氣藥，能有效消散瘀血；三七粉具有活血止血功效，能行血而不溢于脈外；地龍和水蛭破血逐瘀而不會損傷人體正氣；何首烏能補益肝腎、益智安神；遠志和菖蒲具有安神、化痰開竅功效，其中石菖蒲揮發(fā)油有抑制大鼠神經(jīng)細胞凋亡的作用[13],可降低大鼠腦組織興奮性氨基酸的含量, 保護腦細胞, 對癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶具有改善作用[14-15]。上述藥物配合使用，具有醒腦開竅、益氣活血功效，加之部分藥物具有化痰作用，能消散瘀血，補氣養(yǎng)血，改善機體功能。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠學(xué)習(xí)能力明顯低于正常組，各給藥組大鼠的學(xué)習(xí)能力明顯高于模型組。模型組大鼠腦組織中LD、Glu含量明顯高于正常組，各給藥組大鼠腦組織中LD、Glu含量明顯低于模型組。說明VD大鼠腦組織的變化與興奮性氨基酸中毒學(xué)說的描述一致，存在腦組織血液和氧氣供應(yīng)不足，而醒腦丸可改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，有效避免腦細胞受興奮性氨基酸的損害，可有效改善腦組織慢性缺氧狀態(tài)。推測醒腦丸治療VD的機制如下：①腦組織血液和氧氣供應(yīng)不足時，醒腦丸能阻礙興奮性氨基酸的作用，減少Glu在缺血組織的堆積。②醒腦丸可能對Glu、LD的生成具有抑制作用，減少二者在腦組織中的含量，進而發(fā)揮對腦細胞的保護作用。

綜上所述，醒腦丸能夠改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用可能是通過降低腦組織中Glu及LD含量實現(xiàn)的，這為后續(xù)對醒腦丸的作用機制研究提出了思路和方向。

[1] 李愛林. 谷氨酸的興奮性毒性與腦創(chuàng)傷[J]. 國外醫(yī)學(xué)神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊，2005，32(3)：231-234

[2] 胡珺，陳蕓蕓，邢東明，等. 腦缺血時乳酸的生成、轉(zhuǎn)運、代謝和利用[J]. 中國藥理學(xué)通報，2008，24(3)：284-288

[3] 陳振虎,賴新牛,江鋼輝. 實驗性血管性癡呆人鼠動物模型研究進展[J]. 山西醫(yī)藥雜志，2000，5(29):402

[4] 鄭先振,馬光瑜,林玨龍. 納洛酮對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子的影響[J]. 中國新藥與臨床雜志,2005，24(3):185-186

[5] 鄭紅，王文，劉渝，等. 重復(fù)Morris水迷宮訓(xùn)練提高大鼠空間學(xué)習(xí)能力卻不影響空間記憶能力[J]. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2007，23(6)：599-603

[6] 田穎. 血管性癡呆的危險因素及綜合診治的臨床分析[J]. 中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育, 2015, 7(6):42-43

[7] 周鴻雁，毛海峰，王一蓉，等. 腦缺血損傷的研究進展[J]. 湖南文理學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2005，17(2)：72

[8] 疏樹華. 興奮性氨基酸及受體與腦損傷的研究進展[J]. 立體定向和功能性神經(jīng)外科雜志，2007，20 (2):124-126

[9] 陳先震，樓美清，沈照立，等. 腦創(chuàng)傷后繼發(fā)性腦損害的監(jiān)測及其臨床意義[J]. 浙江創(chuàng)傷外科,2010 ，15 (6)：836-839

[10] 黃志雄. 顱腦創(chuàng)傷后的腦細胞凋亡、生化改變與保護措施[J]. 中國醫(yī)師雜志， 2002，4(12)：1418-1420

[11] 陳靜,閻艷麗,宋曉宇. 當(dāng)歸芍藥散研究近況[J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，24(6):379

[12] 張荔,潘志遠,金毅,等. 人參皂苷Rg2對擬血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2008,13(3):276-282

[13] 方永奇,匡忠生,謝宇輝，等. 石菖蒲對缺血再灌注腦損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2002，11(17):1647-1649

[14] 吳祥瑞,黃玉芳. 石菖蒲的化學(xué)成分及對中樞神經(jīng)作用機理實驗研究進展[J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，31(6)：789-790

[15] 唐洪梅,席萍,吳敏，等. 石菖蒲對小鼠腦組織氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J]. 中藥新藥與臨床藥理,2004，15(5):310-311

Effect of Xingnao Pill on glutamic acid and lactic acid content of cerebral tissue in vascular dementia rat

CHEN Jie1, TAO Genyu2

(1. Shaanxi TCM Hospital, Xi’an 710003, Shaanxi, China; 2. Shaanxi University of TCM, Xianyang 712000, Shaanxi, China)

Objective It is to investigate the influence of Xingnao Pill on glutamic acid and lactic acid content of cerebral tissue in vascular dementia rat. Methods Sity rats were randomly selected 8 cases into normal group, the others were duplicated models of vascular dementia rats with the operation of ligating bilateral carotids, and then divided into model group, Naofu Kang group, low-dose Xingnao Pill group, medium-dose Xingnao Pill group, high-dose Xingnao Pill group. At the thirty-fifth day after operation, the animals were treated with Naofu Kang 84 mg/kg gavage in Naofu Kang group, and with Xingnao Pill water solution 0.21, 0.42 and 0.84 g/kg gavage in low-, medium-and high-dose Xingnao Pill group, same amount of normal saline were gavage in normal group and model group, once a day for fourteen days. At the last day of treatment, the behavior experiment of rats were executed, then the glutamic acid and lactic acid content of cerebral tissue in rats were determined. Results The learning and memory ability of rats in the model group was obviously decreased than that in the normal group (P<0.01), the Learning and memory ability of rats in the groups with drug were improved than that in the modle group (allP<0.05). The levels of glutamic acid and lactic acid in cerebral tissue of rat in model group was markedly higher than that in the blank group (P<0.01), and that in each medical group was lower than that in model group (allP<0.05). Conclusion Xingnao Pill could treat vascular dementia by reducing glutamic acid and lactic acid content in cerebral tissue.

Xingnao Pill; vascular dementia; glutamic acid; lactic acid

陳杰，男，中醫(yī)內(nèi)科學(xué)博士后，主治中醫(yī)師，研究方向為腦血管病臨床與基礎(chǔ)研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.36.008

R-332

A

1008-8849(2015)36-4014-03

2015-07-05