楊 倩，劉建平，郎曉猛，邱 貝，杜 姚，郭子敬，張?jiān)气P

(河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

論 著

麻枳降濁方對便秘型腸易激大鼠腸組織中5-HT、MC影響的實(shí)驗(yàn)研究

楊 倩，劉建平，郎曉猛，邱 貝，杜 姚，郭子敬，張?jiān)气P

(河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

目的觀察麻枳降濁方干預(yù)前后便秘型腸易激綜合征大鼠腸組織中5-羥色胺(5-HT)及肥大細(xì)胞(MC)水平，探討該方治療便秘型腸易激綜合征的可能作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)。方法將60只雄性 Wistar 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥物組及麻枳降濁方高、中、低劑量組，各組大鼠正常飼養(yǎng)，不限食水，除正常組外各組均通過冰水灌胃法建立便秘型腸易激綜合征大鼠模型，模型建立后，陽性藥物組給予西沙必利3.6 mg/(kg·d)灌胃，麻枳降濁方高、中、低劑量組分別給予麻枳降濁方顆粒劑25.2 g/(kg·d)、12.6 g/(kg·d)、6.3 g/(kg·d)灌胃，模型組給予常溫蒸餾水灌胃。肉眼觀察大鼠的一般情況。灌胃14 d后處死大鼠，采用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腸道組織中 5-HT 表達(dá)水平，甲苯胺藍(lán)改良法染色后觀察大鼠腸道組織內(nèi)MC計(jì)數(shù)。結(jié)果與模型組相比，各給藥組大鼠一般情況明顯好轉(zhuǎn)，腸道組織中 5-HT 表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)， MC計(jì)數(shù)明顯減少(P<0.05)。結(jié)論麻枳降濁方可能通過降低腸道組織中5-HT 的表達(dá)、減少M(fèi)C 的數(shù)量，從而改善腸道敏感性及動力異常，起到治療便秘型腸易激綜合征的作用。

麻枳降濁方；便秘型腸易激綜合征；5-HT；肥大細(xì)胞

便秘型腸易激綜合征(constipation predominant irritable bowel syndrome ，IBS-C)是臨床上常見的一種以便秘為主癥的腸道功能性疾病，其病理生理學(xué)基礎(chǔ)主要是胃腸動力學(xué)及內(nèi)臟感覺異常，表現(xiàn)為以便秘為主癥的腸功能紊亂性疾病，雖然腸道無器質(zhì)性病變，但整個(gè)腸道對刺激的生理反應(yīng)有過度或反?，F(xiàn)象[1]。本研究通過冰水灌胃法[2]建立 IBS-C大鼠模型，以麻枳降濁方對模型進(jìn)行干預(yù)性治療，采用西沙必利片進(jìn)行陽性藥物對照，觀察大鼠腸組織中5-羥色胺(5-HT)表達(dá)水平及肥大細(xì)胞(mast cell,MC)個(gè)數(shù)的變化，探討麻枳降濁方對 IBS-C 的治療作用及其可能機(jī)制，旨在為臨床治療IBS-C提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1藥物及試劑 麻枳降濁方由麩炒枳實(shí)(0.7 g/袋，批號：1111073，相當(dāng)于飲片6 g)、女貞子(2.3 g/袋，批號：1111203，相當(dāng)于飲片10 g)、旱蓮草(0.7 g/袋，批號：1108155，相當(dāng)于飲片10 g)、火麻仁(2.0 g/袋，批號：1108215，相當(dāng)于飲片10 g)組成，以上顆粒劑由廣東一方制藥有限公司提供。西沙必利片(西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，批號：9801316)。兔免疫組化試劑盒(PK-4001北京博奧森生物科技有限公司)。

1.2動物及模型制備 選取60只清潔級雄性 Wistar 大鼠，體質(zhì)量(140±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動物中心提供(冀醫(yī)動管字 1202182號)，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，觀察大鼠糞便形態(tài)和含水量，均為正常者用于實(shí)驗(yàn)。將Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組10只和造模組50只，2組大鼠均不限食水，正常飼養(yǎng)。造模組每日8:30給予大鼠冰水混合物(生理鹽水)灌胃造模14 d， 以大鼠糞便質(zhì)硬、形態(tài)變小、含水量減少為造模成功標(biāo)準(zhǔn)；造模期間1只大鼠逃逸，1只大鼠出現(xiàn)腹瀉，共有48只大鼠成功建立模型，造模成功率為98%。

1.3分組及給藥 將造模成功大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組9只、陽性藥物組10只、麻枳降濁方高劑量組10只、麻枳降濁方中劑量組10只、麻枳降濁方低劑量組9只，各給藥組藥物劑量按體表面積換算[3]，陽性藥物組給予西沙必利3.6 mg/(kg·d)灌胃，麻枳降濁方高、中、低劑量組分別給予麻枳降濁方顆粒劑25.2 g/(kg·d)、12.6 g/(kg·d)、6.3 g/(kg·d)灌胃，模型組給予等量蒸餾水灌胃，正常組10只正常飼養(yǎng)。于第2周末采用斷頭取血法處死大鼠，取出全胃腸組織，測量小腸推進(jìn)比。取各組大鼠的回盲部、結(jié)腸(距肛門5 cm)、小腸(距回盲部5 cm)各 0.5 cm，生理鹽水沖洗，固定液固定。

1.4觀測指標(biāo)

1.4.1肉眼觀察 通過肉眼觀察造模前后大鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食量、毛色光澤程度、糞便形態(tài)及體質(zhì)量變化等。

1.4.2大鼠腸道組織中5-HT表達(dá)情況 腸道組織標(biāo)本用 10%中性甲醛固定液固定，脫水后常規(guī)蠟塊包埋，制作4 μm 厚石蠟切片，按照 SP 免疫組化試劑盒要求操作，以PBS代替一抗作為陰性對照。腸組織切片出現(xiàn)特異性的棕黃色顆粒為陽性，提示有5-HT表達(dá)；在低倍視野(×100)下觀察反應(yīng)情況，每張切片觀察4個(gè)視野，利用HMIAS-2000彩色圖文分析系統(tǒng)分析陽性的平均光度值。

1.4.3大鼠腸道組織中MC數(shù)量 取各組大鼠的回盲部和結(jié)腸的石蠟切片，采用甲苯胺藍(lán)改良染色法[4-6]染色后，每張每部位取 3 張，每例切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，在400倍OlymPus-BX60光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)MC個(gè)數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀況 正常組大鼠精神良好，糞便呈黃褐色麥粒狀，長約0.9 cm，質(zhì)地較軟，易掰開，尿量正常。模型組大鼠精神可，毛色較正常組無光澤，糞便多呈灰褐色或灰白色小黃豆?fàn)?，可與麥粒狀糞便夾雜相見，長0.4～0.6 cm，質(zhì)地稍硬，個(gè)別不能掰開，尿量正常。

2.2各組大鼠腸道組織病理變化 HE染色顯示各組大鼠結(jié)腸、小腸及回盲部腸組織結(jié)構(gòu)完整，未見充血、水腫、糜爛等病理改變。光鏡下5-HT陽性細(xì)胞主要集中在腸道黏膜上皮層、黏膜層腺體及腸肌間神經(jīng)叢，黏膜層5-HT陽性細(xì)胞呈腺管樣排列，散布于腺管之間及黏膜下層，胞漿呈棕黃色至褐色。光鏡下觀察腸組織切片中MC呈散在分布，圓形、橢圓形等；部分MC呈脫顆粒狀態(tài)，細(xì)胞呈不規(guī)則形，其脫顆粒散布于細(xì)胞膜的周圍；部分MC未見脫顆粒狀態(tài)，其細(xì)胞形態(tài)規(guī)則且細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)未見異常變化。MC主要分布在黏膜下層以及黏膜固有層內(nèi)；細(xì)胞質(zhì)被甲苯胺藍(lán)染成紫紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色，部分細(xì)胞中胞質(zhì)呈現(xiàn)紫紅色分布不均，考慮可能與染色過程中乙醇分色時(shí)間把握不恰當(dāng)有關(guān)。

2.3各組大鼠腸道組織中5-HT表達(dá)情況 模型組大鼠腸道各部位組織中5-HT陽性表達(dá)水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，各給藥組5-HT陽性表達(dá)水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，麻枳降濁方高、中劑量組5-HT陽性表達(dá)水平均明顯低于陽性藥物組(P均<0.05)。見表 1。

表1 各組大鼠腸道組織切片光度值比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與陽性藥物組比較，P<0.05。

2.4各組大鼠腸道組織中MC計(jì)數(shù)比較 模型組大鼠腸道各部位組織中MC計(jì)數(shù)均明顯高于正常組(P均<0.05)，各給藥組MC明顯多于模型組(P均<0.05)，各給藥組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

3 討 論

隨著對 IBS-C 發(fā)病機(jī)制的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)該病發(fā)生與以下機(jī)制有關(guān)：①胃腸動力學(xué)。Manabe等[7]提出 IBS-C患者腸道平滑肌運(yùn)動障礙導(dǎo)致結(jié)腸蠕動速度明顯減慢。②內(nèi)臟感覺異常。鄒多武等[8-9]研究證實(shí)IBS-C患者存在內(nèi)臟感覺異常。③感染相關(guān)機(jī)制。賀星等[10]研究提出導(dǎo)致疾病發(fā)生的主要原因可能是腸道感染破壞腸黏膜屏障以及腦-腸軸，或者細(xì)菌滋生。④神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。楊云生[11]在總結(jié)前人對IBS發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地提出了“神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制”。⑤其他因素[12-13]，如社會因素以及個(gè)人心理因素、飲食因素。

表2 各組大鼠腸道組織中MC計(jì)數(shù)比較，個(gè))

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

5-HT是一種廣泛分布的神經(jīng)遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)消化道功能的作用，幾乎參與所有IBS的病理生理過程[14]。胃腸道腺腔底部的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(endocrinecell,EC)主要合成、分泌并再攝取外周神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT，某些病理性刺激(如缺血、應(yīng)激)及生理性刺激(如進(jìn)食、擴(kuò)張)可促使神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞釋放5-HT。5-HT的增加一方面提高了內(nèi)臟神經(jīng)系統(tǒng)的高敏性，激活了多種神經(jīng)活性物質(zhì)，使參與腦-腸調(diào)節(jié)的化學(xué)信號異常表達(dá)，另一方面5-HT與其各種受體結(jié)合作用于患者的腸道感知、運(yùn)動及分泌系統(tǒng)，從而產(chǎn)生了各種臨床癥狀[15]。由此可見， 5-HT在IBS-C的發(fā)病中具有重要意義。

伴隨“免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)”理論的提出，MC在此理論中也受到了更多的關(guān)注。神經(jīng)系統(tǒng)功能、胃腸道感覺和運(yùn)動等都與MC有不同程度的關(guān)系。MC存在于人體的結(jié)締組織內(nèi)，其中血管、淋巴以及神經(jīng)周圍分布較為廣泛，其在變態(tài)反應(yīng)、防御性免疫反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)中起到了重要作用[16]。MC功能主要依靠“脫顆粒”的形式實(shí)現(xiàn)，可釋放包括組胺、5-HT、白細(xì)胞介素等在內(nèi)的多種遞質(zhì)[17]。在IBS-C發(fā)病過程中，MC扮演著極為重要的角色，當(dāng)MC受到非免疫性或/和免疫性刺激時(shí)被激活，從而釋放多種具有生物活性的遞質(zhì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生及發(fā)展[18]。李兆申等[19]研究發(fā)現(xiàn)MC穩(wěn)定劑或MC產(chǎn)物拮抗劑可能存在治療作用。王偉岸等[20]的臨床觀察及動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)MC參與IBS內(nèi)臟高敏感形成。故認(rèn)為對MC的研究是攻克IBS的重要途徑。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療較為局限，多為對癥治療，應(yīng)用緩瀉劑、促進(jìn)胃腸動力劑、解痙止痛劑以及抗焦慮抑郁等藥物，但會出現(xiàn)腹瀉、電解質(zhì)紊亂等，長期服用會出現(xiàn)藥物耐受和依賴性。

中醫(yī)中并沒有IBS-C病名的記載，根據(jù)其腹痛及便秘的癥狀，屬“便秘”“郁證”“腹痛”等范疇，“脾約”“不更衣”“陰結(jié)”“陽結(jié)”等也與IBS-C相關(guān)。對于IBS-C的中醫(yī)病因病機(jī)大致包括情志內(nèi)傷、外邪入里生毒、內(nèi)生毒邪、肝腎陰虛、腸燥熱結(jié)、肺氣郁閉，瘀血內(nèi)停等。在李佃貴教授“濁毒”理論[21]的基礎(chǔ)上，結(jié)合筆者多年臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為IBS-C發(fā)病的基本病機(jī)為濁毒內(nèi)蘊(yùn)致大腸傳導(dǎo)失司，病位在大腸，與肝、脾、腎關(guān)系密切，“濁毒”既是致病原因，同時(shí)也是病理基礎(chǔ)。濁毒或因外邪六淫入里，或因內(nèi)邪郁久化毒等多種因素聚集，濁毒乃成。濁毒在肺，傷及華蓋之氣，宣降失常，“肺與大腸相表里”，病機(jī)傳變致大腸傳導(dǎo)失司；濁毒在肝，肝失條達(dá)，氣機(jī)升降失常，或因肝氣橫逆犯脾，肝脾不和，脾失健運(yùn)，傳化失常；濁毒在腎，“腎司二便”功能失職，均導(dǎo)致糟粕內(nèi)停，大便難，從而導(dǎo)致本病發(fā)生。因此以降濁解毒、補(bǔ)益肝腎大法總結(jié)出經(jīng)驗(yàn)方——麻枳降濁方治療。該方以火麻仁及枳實(shí)入脾、胃、大腸經(jīng)，女貞子、墨旱蓮皆入肝、腎經(jīng)。重用火麻仁潤腸通便解毒為君藥，且兼具滋養(yǎng)之功；枳實(shí)理氣消積降濁，為臣藥，且能在恢復(fù)“脾升胃降”的同時(shí)兼消腸道之積；女貞子、墨旱蓮為中醫(yī)名方二至丸，滋補(bǔ)肝腎治其本，兼有“舟車”之義。全方攻中寓補(bǔ)，攻補(bǔ)兼施，共奏疏肝理脾、補(bǔ)益肝腎、潤腸通便之功。

本研究以5-HT、MC在腸道組織中的表達(dá)為切入點(diǎn)，觀察了麻枳降濁方對IBS-C的治療作用及作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腸道組織中5-HT的表達(dá)水平模型組明顯高于正常組，大鼠回盲部及結(jié)腸組織中MC計(jì)數(shù)明顯多于正常組，可見5-HT、MC與IBS-C發(fā)生密切相關(guān)；麻枳降濁方各劑量組5-HT表達(dá)水平及MC計(jì)數(shù)均較模型組明顯降低，提示麻枳降濁方可有效抑制5-HT在腸道組織中的表達(dá)以及減少回盲部及結(jié)腸組織的MC計(jì)數(shù)。故推測麻枳降濁方可能通過降低大鼠腸道組織中5-HT的表達(dá)、減少M(fèi)C的數(shù)量，從而改善腸道敏感性及動力異常，起到治療IBS-C的作用。

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Experimental study on the influence of Mazhi Jiangzhuo Prescription on 5-HT, MC in the intestinal tissueof rat with constipation predominant irritable bowel syndrome

YANG Qian, LIU Jianping, LANG Xiaomeng, QIU Bei, DU Yao, GUO Zijing, ZHANG Yunfeng

(HeBei Provincial Hospital of TCM, Shijiazhuang 050011, HeBei, China)

Objective It is to observe the influence of Mazhi Jiangzhuo Prescription (MZJZP) on the 5-HT and number of the mast cell in the rats with constipation predominant irritable bowel syndrome(IBS-C), and explore the possible mechanism of this method in treating IBS-C and its potential target. Methods Sixty Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, positive drug group and MZJZP high, medium, low dose groups, normal feeding, not limited to fresh wate. Except the normal group, the rat model of IBS-C in other groups were establish by gavage with icy water for 2 weeks. Then the rats were treated with Cisapride in the positive drug group, MZJZP of 25.2, 12.6 and 6.3 g/(kg·d) in the MZJZP high, medium and low dose groups, and distilled wate in the model group. The general condition of rats was observed by the naked eye. After 14 days of treatment the rats were killed to observed the mast cell count in the rats of intestinal tissue by HE method, and the level of 5-HT by immunohistochemistry. Results Compared with the model group, the other rats with IBS-C were significantly improved in general, the expression of 5-HT was significantly decreased (P<0.05), and the mast cell count was markedly decrease in the intestinal tissue (P<0.05). Conclusion MZJZP maybe decreased the expression of 5-HT in the intestinal tissues, and reduce the number of MC, thereby improving the sensitivity and intestinal motility disorders to treat IBS-C.

Mazhi Jiangzhuo Prescription; constipation predominant irritable bowel syndrome; 5-hydroxytryptamine; mast cell

楊倩，女，主任醫(yī)師,教授,碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橹嗅t(yī)消化系統(tǒng)疾病的診治。

劉建平，E-mail：13603396653@163.com

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(10246141D)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.36.001

R-332

A

1008-8849(2015)36-3991-04

2015-05-18